抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

陳曉博，李俊?

①上海科技大學(xué) 免疫化學(xué)研究所，上海 201210；②上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

1 結(jié)核病

結(jié)核病（tuberculosis）是一種主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的嚴(yán)重傳染病。全球大約1/4人口感染結(jié)核分枝桿菌，其中大部分處于潛伏期，約1/10感染者最終發(fā)展成為結(jié)核病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告[1]，僅2019年，結(jié)核病新發(fā)病例約1 000萬例，死亡病例約120萬例。其致死率已經(jīng)超過艾滋病，位列傳染病的第一位。結(jié)核病是困擾人類數(shù)千年的傳染病，被列為全球十大死因之一，同時(shí)也是單一傳染病中的頭號(hào)殺手。當(dāng)前用于治療結(jié)核病的藥物大部分是20世紀(jì)40—70年代發(fā)現(xiàn)的，已經(jīng)使用了半個(gè)多世紀(jì)。常見的抗結(jié)核治療藥物[2]如表1所示。結(jié)核病的治療通常需要四種以上的一線藥物聯(lián)用，療程在半年以上才能治愈。當(dāng)一線藥物療效不明顯時(shí)輔以二、三線藥物。近年來，由于傳統(tǒng)藥物的長(zhǎng)期使用和不規(guī)范治療，臨床上產(chǎn)生的耐藥問題越來越嚴(yán)重。多藥耐藥（multi-drug resistance,MDR）[3]、廣泛耐藥（extensively drug-resistance,XDR）[4]和全耐藥（total drug-resistance,TDR）[5]結(jié)核菌株的出現(xiàn)，使得現(xiàn)有藥物和治療方案難以奏效，甚至面臨無藥可醫(yī)的危險(xiǎn)境地。一旦這些耐藥菌株廣泛傳播，后果不堪設(shè)想。因此，研發(fā)新型抗結(jié)核藥物成為全人類迫在眉睫的任務(wù)。

表1 常見的抗結(jié)核治療藥物

2 結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成與能量代謝

結(jié)核病的防治和新藥研發(fā)首先需要發(fā)現(xiàn)和闡明其致病菌關(guān)鍵生理活動(dòng)的分子機(jī)制。其中，結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成過程和能量代謝過程被認(rèn)為是理想突破口，許多抗結(jié)核藥物和在研藥物均作用于這些重要生理途徑。比如，一線藥物異煙肼（isoniazid）和乙胺丁醇（ethambutol）、臨床在研藥物SQ109均是通過抑制細(xì)胞壁合成發(fā)揮抗結(jié)核作用的，上市新藥唄達(dá)喹啉（bedaquilin）和臨床在研藥物Q203則通過抑制能量代謝途徑的呼吸鏈達(dá)到殺死結(jié)核菌的效果。

結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和組成，是病原體抵抗環(huán)境壓力，免受抗生素殺傷和逃避宿主免疫反應(yīng)的天然屏障[6]。其結(jié)構(gòu)和組成與革蘭氏陽性/陰性細(xì)菌以及真菌都存在顯著差異[7-8]，結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁組分肽聚糖（peptidoglycan,PG）、阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan,AG）、分枝菌酸（mycolic acid,MA）、脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan,LAM）等均是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子，其合成、運(yùn)輸、組裝、調(diào)控等需要一系列酶和轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白參與完成[9]。破壞細(xì)胞壁的完整性不僅有助于殺菌藥物的進(jìn)入，還會(huì)嚴(yán)重地影響病原體的生存，故細(xì)胞壁合成通路中的關(guān)鍵蛋白被公認(rèn)為是很好的藥物靶標(biāo)[10]。

在近年的研究中，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌能量代謝系統(tǒng)，特別是氧化磷酸化途徑的靶標(biāo)研究已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。雖然病原菌的有氧呼吸與真核生物類似，都依賴于一系列蛋白質(zhì)復(fù)合體，包括復(fù)合物I（NADH：醌氧化還原酶）、復(fù)合物II（琥珀酸：醌氧化還原酶）、復(fù)合物III（醌：細(xì)胞色素c氧化還原酶）、復(fù)合物IV（細(xì)胞色素c氧化酶）和復(fù)合物V（ATP合成酶），但是其結(jié)構(gòu)和組裝形式與真核線粒體和革蘭氏陽性/陰性細(xì)菌均存在顯著差異，其獨(dú)特的特點(diǎn)使相關(guān)復(fù)合物成為理想的藥物靶點(diǎn)。

3 細(xì)胞壁分枝菌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MmpL3的結(jié)構(gòu)研究

MmpL3是一個(gè)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞壁分枝菌酸前體的膜蛋白。當(dāng)分枝菌酸在細(xì)胞內(nèi)合成后被海藻糖修飾形成海藻糖單霉菌酸酯（trehalose monomycolate,TMM），MmpL3可以將TMM從胞內(nèi)側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)腔。TMM進(jìn)一步被加工運(yùn)輸后整合至細(xì)胞壁外膜（分枝菌酸層）[11]。MmpL3屬于RND超家族[12-13]，是結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的必需基因。同時(shí)，MmpL3也是當(dāng)前研究的熱門藥物靶點(diǎn)之一。到目前為止，大約有8類不同分子構(gòu)型的具有抗菌活性的MmpL3抑制劑被發(fā)現(xiàn)，其中乙二胺類的SQ109已處于2b-3期臨床試驗(yàn)階段。該小分子對(duì)耐藥菌株有很好的殺菌效果，具有極低的耐藥突變率，有望成為新的抗結(jié)核治療藥物[14]。

針對(duì)分枝桿菌MmpL3的結(jié)構(gòu)研究顯示[15]，其晶體結(jié)構(gòu)包括兩部分：跨膜結(jié)構(gòu)域（TMN和TMC）和細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)域（PN和PC）（圖1a）。跨膜結(jié)構(gòu)域主要由12個(gè)跨膜α螺旋組成。細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)域共包括7個(gè)α螺旋和6個(gè)β片層。MmpL3具有一個(gè)假二次對(duì)稱軸，形成尺寸大約為93 ?×55 ?×25 ?的分子機(jī)器。PN和PC相互嵌合形成一個(gè)三端開口（GF、GB、GT）的空腔（cavity）。在每個(gè)開口的入口處都存在大量的親水性氨基酸，而空腔的內(nèi)部主要由疏水氨基酸組成。在跨膜螺旋TMH4和TMH10的中部，存在4個(gè)親水的氨基酸Asp256、Tyr257、Asp645和Tyr646。它們之間通過形成氫鍵的方式組成“天冬氨酸-酪氨酸”殘基對(duì)（Asp256-Tyr646和Asp645-Tyr257）（圖1b），這兩對(duì)親水氨基酸對(duì)對(duì)跨膜螺旋TMH4和TMH10之間的穩(wěn)定有重要的作用。在其他RND家族成員中，同樣存在類似的親水氨基酸。這些跨膜區(qū)的親水氨基酸殘基已被證明參與質(zhì)子的內(nèi)流，為底物轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供能量，因此對(duì)蛋白的功能至關(guān)重要[16-18]。在細(xì)胞間質(zhì)的空腔中，存在兩個(gè)6-DDTre分子，它們與底物TMM分子具有一定的相似性，即都具有相同的海藻糖頭部和疏水的烴鏈尾巴，區(qū)別在于6-DDTre僅含有一條12個(gè)碳的脂肪酸鏈尾巴。綜合以上信息，可以推測(cè)出一個(gè)MmpL3轉(zhuǎn)運(yùn)TMM的可能的機(jī)制模型：MmpL3以某種方式把位于細(xì)胞膜的TMM從細(xì)胞膜上拽出，經(jīng)GF的開口進(jìn)入PN和PC形成的空腔中，再經(jīng)GT開口釋放，從而完成底物TMM的向外轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)的過程需要依靠質(zhì)子內(nèi)流產(chǎn)生的動(dòng)力驅(qū)動(dòng)，而位于跨膜區(qū)的“天冬氨酸-酪氨酸”殘基對(duì)介導(dǎo)了質(zhì)子內(nèi)流這一過程。以上模型仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[15]。

圖1 MmpL3結(jié)構(gòu)與抗結(jié)核小分子作用方式：（a）MmpL3整體結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分布；（b）TMH4和TMH10存在親水的“天冬氨酸-酪氨酸”殘基對(duì)；（c）SQ109的結(jié)合方式；（d）SQ109、AU1235、ICA38和Rimonabant結(jié)合方式比較

MmpL3與小分子抑制劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)一步揭示了抗結(jié)核藥物的精確作用機(jī)制[15]。MmpL3-SQ109復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，SQ109分子呈蝌蚪樣形狀結(jié)合于MmpL3跨膜區(qū)中心。與apo結(jié)構(gòu)相比，MmpL3的跨膜區(qū)TMN和TMC相互遠(yuǎn)離張開，在內(nèi)部形成一個(gè)口袋，SQ109則結(jié)合于口袋之中。其相互作用由跨膜區(qū)4圈圍繞的氨基酸參與，主要為疏水相互作用（圖1c）。值得注意的是，“天冬氨酸-酪氨酸”殘基對(duì)的相互作用被破壞，SQ109乙二胺骨架上的兩個(gè)氮原子均與Asp645形成氫鍵。MmpL3-AU1235復(fù)合物和MmpL3-ICA38復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，這兩個(gè)抑制劑同樣都結(jié)合于跨膜區(qū)中心的口袋中，而且通過結(jié)構(gòu)的疊合發(fā)現(xiàn)，盡管小分子間的結(jié)構(gòu)有所差異，它們?cè)贛mpL3中的結(jié)合位置和方式與SQ109十分相似（圖1d）。利莫那班（Rimonabant）是作用于大麻素受體CB1的拮抗劑，曾用作治療肥胖的減肥藥[19]。研究發(fā)現(xiàn)，利莫那班也是一個(gè)靶向MmpL3的抗結(jié)核小分子。MmpL3-Rimonabant復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，該小分子雖然也結(jié)合在MmpL3的跨膜區(qū)，但是由于分子骨架與SQ109截然不同，其結(jié)合方式與SQ109也存在顯著差異（圖1d）。總體上來說，Rimonabant占據(jù)了更多的口袋區(qū)域。進(jìn)一步分析表明，4個(gè)抗結(jié)核小分子均作用于MmpL3的質(zhì)子內(nèi)流通道上，破壞了關(guān)鍵的“天冬氨酸-酪氨酸”殘基對(duì)的相互作用，從而切斷了MmpL3轉(zhuǎn)運(yùn)底物的能量來源，最終阻斷了細(xì)胞壁分枝菌酸層的合成，達(dá)到抑制結(jié)核桿菌的功效[15]。MmpL3的結(jié)構(gòu)信息及其靶向分子的精確作用方式可以為新型抗結(jié)核藥物的設(shè)計(jì)提供重要思路。

4 細(xì)胞壁阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶EmbAEmbB和EmbC-EmbC的結(jié)構(gòu)研究

EmbA、EmbB和EmbC均是參與細(xì)胞壁阿拉伯聚糖合成的阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶（arabinosyltransferase），屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族GT-C中的GT-53家族。其中，EmbA和EmbB參與阿拉伯半乳聚糖AG的合成[20]，而EmbC參與脂阿拉伯甘露聚糖LAM的合成[21]。三者之間具有大約40%的序列同源性和相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Emb蛋白均是利用DPA（decaprenyl-phosphate-arabinose）作為阿拉伯糖供體，將阿拉伯單糖轉(zhuǎn)移至特定的阿拉伯聚糖受體上，完成阿拉伯聚糖的延伸或者分枝。研究表明，結(jié)核桿菌中的Emb蛋白均是無法敲除的關(guān)鍵蛋白[22]。另外，一線藥物乙胺丁醇的臨床耐藥突變大多發(fā)生在Emb蛋白上，尤其集中在EmbB蛋白[23-26]。Emb蛋白的活性測(cè)試表明，乙胺丁醇可以抑制其活性，因而是這些蛋白的直接作用靶點(diǎn)[27]。

結(jié)構(gòu)研究表明[27]，EmbA和EmbB形成異源二聚體，EmbC形成同源二聚體（圖2a）。兩者的二聚化形式相似，均是通過跨膜區(qū)的相互作用穩(wěn)定二聚體結(jié)構(gòu)。在每個(gè)Emb蛋白的胞內(nèi)側(cè)均結(jié)合了一個(gè)?；d脂蛋白AcpM。Emb蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，均含有一個(gè)15次跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè)N端胞外結(jié)構(gòu)域（PN）和一個(gè)C端胞外結(jié)構(gòu)域（PC）（圖2b）。PN結(jié)構(gòu)域采用Jelly-roll的折疊形式，這種形式一般與多糖的結(jié)合有關(guān)[28]。PC結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分為兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)也是采用Jellyroll的折疊形式。Emb蛋白的活性口袋位于跨膜區(qū)和胞外區(qū)的連接處，有兩個(gè)開口可以進(jìn)入，分別是供體通道和受體通道（圖2c）?？诖鼉?nèi)部存在高度保守的DDx基序，基序上的天冬氨酸殘基負(fù)責(zé)催化反應(yīng)。在解析的EmbA-EmbB和EmbCEmbC復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，底物DPA和阿拉伯二糖分子均結(jié)合于活性口袋中。在EmbA的結(jié)構(gòu)中，DPA中的阿拉伯糖基團(tuán)從供體通道伸入活性口袋，結(jié)合于催化殘基一側(cè)，癸烯基尾巴則結(jié)合于口袋外部的跨膜區(qū)。在EmbB和EmbC結(jié)構(gòu)中，阿拉伯二糖分子的兩個(gè)阿拉伯糖基團(tuán)分別結(jié)合于催化殘基的兩側(cè)，因此，阿拉伯二糖分子被認(rèn)為是模擬了反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)合方式，其中一個(gè)阿拉伯基代表原受體末端的糖基，而另一個(gè)則代表被轉(zhuǎn)移后新生成的糖基。底物的結(jié)合信息最終幫助推導(dǎo)出了Emb蛋白的反應(yīng)機(jī)制[27]。

在EmbB和EmbC的結(jié)構(gòu)中，均發(fā)現(xiàn)了乙胺丁醇的存在[27]。該藥物分子均結(jié)合于EmbB和EmbC的活性口袋中。乙胺丁醇分子中的二胺基團(tuán)位于催化殘基附近（圖2d），在結(jié)合過程中發(fā)揮了重要作用。其他基團(tuán)同時(shí)與活性口袋附近的氨基酸殘基相互作用，包括極性相互作用和范德華作用等，進(jìn)一步穩(wěn)定了藥物分子的結(jié)合。結(jié)構(gòu)疊合分析顯示，乙胺丁醇的結(jié)合位置幾乎與阿拉伯二糖重合（圖2e）。由此可以推出，乙胺丁醇競(jìng)爭(zhēng)性地阻礙了阿拉伯糖供體和受體的結(jié)合，從而抑制Emb蛋白的糖基轉(zhuǎn)移功能，進(jìn)一步阻斷了細(xì)胞壁的合成，抑制了結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)。將關(guān)于Emb蛋白的臨床耐藥突變數(shù)據(jù)展示在Emb蛋白的結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)，大部分突變位點(diǎn)集中于活性口袋附近，這一結(jié)果與乙胺丁醇的結(jié)合位點(diǎn)一致。結(jié)構(gòu)信息進(jìn)一步對(duì)部分位點(diǎn)的突變提供了合理的解釋，如Met306、Gly406、Gln497等[24-26,29]，從而在分子水平上闡明了乙胺丁醇耐藥性的成因[27]。

圖2 EmbA-EmbB復(fù)合物與EmbC-EmbC復(fù)合物結(jié)構(gòu)及乙胺丁醇作用方式： （a）EmbA-EmbB異源二體結(jié)構(gòu)和EmbC-EmbC同源二體結(jié)構(gòu)，AcpM結(jié)合于每個(gè)Emb蛋白的胞內(nèi)側(cè)；（b）單個(gè)Emb蛋白的整體結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分布；（c）通向活性位點(diǎn)的供體通道和受體通道；（d）乙胺丁醇的結(jié)合位點(diǎn)；（e）乙胺丁醇結(jié)合位置與阿拉伯二糖重合

5 能量代謝呼吸鏈超級(jí)復(fù)合體CIII2CIV2SOD2的結(jié)構(gòu)研究

分枝桿菌的呼吸鏈同樣需要復(fù)合物I、II、III、IV、V參與，但是其組成和組裝形式與真核生物或其他原核生物存在差異。比如，分枝桿菌中不存在游離的細(xì)胞色素c[30]。在真核生物中，細(xì)胞色素c介導(dǎo)了復(fù)合物III和復(fù)合物IV之間的電子傳遞。在細(xì)菌中，有些細(xì)胞色素c是以錨定在細(xì)胞膜的形式來連接III-IV間的電子傳遞的，而另一些則是將細(xì)胞色素c以結(jié)構(gòu)域的形式融合到復(fù)合物IV上。分枝桿菌等放線菌將細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)域融合于復(fù)合物III上，并且與復(fù)合物IV組裝在一起形成超級(jí)復(fù)合體[31-32]。研究表明，結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈復(fù)合體III是一個(gè)具有重要臨床意義的藥物靶點(diǎn)，它能夠與目前處在臨床II期的藥物分子Telacebec（Q203）[33]相互作用進(jìn)而抑制其電子傳遞功能，阻斷有氧呼吸途徑。

分枝桿菌的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合體III-IV的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)通過冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)法得到解析[34]。結(jié)合質(zhì)譜、光譜、磁共振等方法對(duì)天然提取的超級(jí)復(fù)合體樣品進(jìn)行分析鑒定，共發(fā)現(xiàn)24個(gè)蛋白亞基、44個(gè)脂質(zhì)分子、24個(gè)電子傳遞配體分子，總分子量達(dá)870 kDa。復(fù)合體中，兩個(gè)III形成二體，兩個(gè)IV分別結(jié)合于兩側(cè)，形成IV-III-III-IV的線性排列，具有二次軸對(duì)稱性。III-IV的結(jié)合界面通過組裝因子PRSAF1、LpqE和SOD連接穩(wěn)固。另外，許多磷脂分子分布于III-III、III-IV的界面上，進(jìn)一步穩(wěn)定了整個(gè)復(fù)合體（圖3a）。研究人員在結(jié)構(gòu)中首次發(fā)現(xiàn)了超氧化物岐化酶SOD二體的存在，其通過脂修飾的N末端錨定在復(fù)合物III二體的胞外側(cè)。已知SOD的功能為清除氧自由基，因此可以推測(cè)，SOD的存在是為了盡快清除復(fù)合物III-IV電子傳遞過程中發(fā)生電子泄漏而產(chǎn)生的自由基。在復(fù)合物III中，血紅素heme bH、heme bL、鐵硫簇[2Fe-2S]、血紅素heme cD1、heme cD2的位置可以被確定；在復(fù)合物IV中，CuA、CuB、血紅素heme a/a3的位置也得到確定。這些可以發(fā)生氧化還原的配體以一定距離串聯(lián)分布于超級(jí)復(fù)合體之中（圖3b），可以允許電子通過量子遂穿效應(yīng)進(jìn)行傳遞，從低電勢(shì)流向高電勢(shì)。因此，復(fù)合體的結(jié)構(gòu)信息可以幫助揭示電子如何進(jìn)行傳遞，從復(fù)合物III醌結(jié)合位點(diǎn)QP最終流向復(fù)合物IV的heme a3:CuB反應(yīng)中心，與氧氣反應(yīng)生成水。電子傳遞的同時(shí)，質(zhì)子從胞內(nèi)側(cè)被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)腔中形成跨膜電勢(shì)差[34]。

進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)[34]，電子供體甲基萘醌（menaquinol,MK）結(jié)合于QP和QN口袋中（圖3c和3d）。由于復(fù)合物III的醌結(jié)合口袋QP和QN的氨基酸組成與真核線粒體的復(fù)合物III存在顯著不同，該位點(diǎn)被認(rèn)為是抑制劑設(shè)計(jì)的理想位點(diǎn)。事實(shí)上，QP口袋中的313位Thr氨基酸的突變可以引起Q203的耐藥[33]，因而Q203很可能是靶向QP位點(diǎn)的。進(jìn)一步藥物作用機(jī)制的闡明需要復(fù)合物與Q203的結(jié)構(gòu)解析才能實(shí)現(xiàn)。當(dāng)前的超級(jí)復(fù)合物結(jié)構(gòu)為我們提供了電子傳遞分子機(jī)器的豐富信息，在揭示其功能機(jī)制的同時(shí)，也使得我們有可能通過靶向呼吸鏈電子傳遞過程找到抗結(jié)核的有效手段。

圖3 呼吸鏈復(fù)合物CIII2CIV2SOD2結(jié)構(gòu)：（a）CIII2CIV2SOD2結(jié)構(gòu)組裝形式和組成成分；（b）復(fù)合物中的氧化還原配體及空間分布；（c）底物醌在QP位點(diǎn)的結(jié)合方式；（d）底物醌在QN位點(diǎn)的結(jié)合方式

6 總結(jié)與展望

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和研究水平的提高，結(jié)核桿菌膜蛋白及其復(fù)合物樣品的獲取和結(jié)構(gòu)研究成為可能，最終促成了多個(gè)長(zhǎng)期以來從未被攻克的膜蛋白類的抗結(jié)核藥靶結(jié)構(gòu)的解析。這一系列工作幫助我們清晰地觀察到關(guān)鍵蛋白質(zhì)的精細(xì)三維構(gòu)造，從而在分子水平上對(duì)其生理功能進(jìn)行了精確的闡釋。更為重要的是，多個(gè)藥物和候選化合物的靶向作用機(jī)制得到了詳細(xì)的闡明，相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合方式為新型抗結(jié)核小分子的開發(fā)提供了非常有價(jià)值的信息。相信不久的將來，對(duì)于這些靶點(diǎn)的新藥開發(fā)一定會(huì)取得重要突破。隨著抗結(jié)核藥靶研究的深入，會(huì)有更多重要靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)被解析，從而加快整個(gè)抗結(jié)核藥物研發(fā)的進(jìn)程。