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    Nrf2/HO-1通路及氧化應激介導的及己地上部分醇提取物致大鼠肺毒性研究

    2021-10-27 00:48:22朱恩澤孫淑萍吳晨光李安琪杜云艷謝先進
    通化師范學院學報 2021年10期
    關鍵詞:勻漿毒性提取物

    朱恩澤,孫淑萍,吳晨光,李安琪,孫 琪,杜云艷,謝先進

    及己(Chloranthus serratusRoem.et Schalt.)為金粟蘭科金粟蘭屬植物,通常以根、全草或地上部分入藥.它具有解毒消腫、活血化瘀、祛風止痛、抗菌消炎、通筋活絡的功效,可以治療跌打損傷、癤腫等癥.研究證實,及己有明顯的抗炎活性[1?2],但同時具有毒性,服用過量的及己會導致患者手足抽搐、嘔吐、結膜充血等,甚至出現(xiàn)死亡[3].尚不清楚及己何種部位在保持良好治療效果的同時毒性較小.前期實驗結果顯示,及己根、莖、葉醇提取物的心臟毒性作用機制可能與激活脂質過氧化物酶有關[4].通過比較及己根和雷公藤誘導的大鼠肺毒性大小發(fā)現(xiàn),及己水提取物可能通過激發(fā)氧化應激并調(diào)控Nrf2/HO?1通路誘導肺毒性[5].張武等研究表明,因及己中毒死亡的小鼠經(jīng)肉眼觀察肺組織有淤血水腫.光鏡下,肺組織和毛細血管出現(xiàn)淤血擴張、灶性出血及局部肺水腫的癥狀,且部分肺泡腔內(nèi)可見蛋白性液體[6].以上均表明,及己具有肺毒性,但是其與劑量的相關性尚無明確的定論.

    多項研究均表明及己對多種臟器有毒性[7],其中,最易受損的是肺組織,因為它是含氧量最多的器官,所以最易受內(nèi)源性和外源性氧自由基損傷[8].因此,在肺組織中發(fā)生的氧化損傷可能是大鼠發(fā)生肺損傷的首要原因.未見文獻報道及己地上部分醇提取物高低劑量致肺毒性是否呈劑量依賴性,且其毒性機制尚不明確.中草藥的合理利用受到國內(nèi)外多數(shù)學者和專家關注,中藥確有良好的治療作用,但其臨床應用一直受其毒性限制,成為中藥合理利用的一道難題.因此,當開發(fā)和合理利用中藥時,我們必須對其毒性進行研究.

    目前比較明確的中藥毒性機制為機體產(chǎn)生的氧自由基參與氧化應激反應從而對機體產(chǎn)生毒性[9].在氧自由基產(chǎn)生和消耗達到平衡時,機體能夠維持正常的生理狀態(tài),這種平衡一旦被打破,就會誘發(fā)氧化應激損傷.一般情況下,肺能夠清除體內(nèi)氧自由基,使其產(chǎn)生和清除保持恒定,是因為肺細胞內(nèi)含有許多具有較好的氧自由基清除功效的酶參與氧自由基的清除,并抵抗氧自由基造成的肺組織損傷[10].和氧化應激直接相關的指標為總超氧化物歧化酶(T?SOD)、脂質過氧化產(chǎn)物?丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)等.

    本實驗初步考察了及己地上部分醇提取物的肺毒性大小,并初步探討了其毒性機制,為及己安全合理應用于臨床提供了參考依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 實驗藥物

    及己采收于廣西玉林,經(jīng)皖南醫(yī)學院朱建華教授參考《中藥大辭典》及中國植物圖譜數(shù)據(jù)庫鑒定為真品,常溫干燥保存.

    1.2 動物

    Sprague?Dawley(SD)大鼠(清潔級雄性),體重200±10 g,從青龍山動物場獲得,批準文號:19?014.飼養(yǎng)條件:溫度24~26℃、相對濕度40%~60%、通風且每天光照12 h、自由攝食和飲水,適應性喂養(yǎng)一周后用于實驗.

    1.3 試劑

    GSH(批 號:20190615)、CAT(批 號:20190614)、T?SOD(批號:20190613)、MDA(批號:20190616)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:020817170505)、BeyoECL plus化學發(fā)光試劑盒(批號:030519190603)均購自Beyotime Biotech?nology;Mouse Anti?β?Actin(批號:66240?1?LS)、Goat Anti?Mouse IgG(批 號:BST12F21C50)、Rabbit Anti Nrf2(批號:16396?1?AP,美國Pro?teintech公司)、Rabbit Anti HO?1(批號:ZP10 39BP39)、Goat Anti?Rabbit IgG(批 號:BST12 L05A54)、免疫組化三步法試劑盒(批號:12H25C)均購自BOSTER Biological Technology Co.Ltd.

    1.4 儀器

    高速冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司);Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀(General Electric Company);伯樂電泳儀(Bio?Rad)(上海啟步生物科技有限公司);EPOCH全波長酶標儀(深圳山特電子有限公司);CKX3OLYMpUS顯微鏡(昆山諾普森實驗室用品科技有限公司);日立U?5100分光光度計(日本日立有限公司)等.

    1.5 方法

    1.5.1 提取物的制備

    將及己地上部分洗凈、干燥、粉碎至粗粉并稱取適量,用12倍量75%乙醇浸泡0.5 h,回流提取1.5 h;然后依次用10倍、8倍75%乙醇分別回流提取1.0 h,每次抽濾、合并3次濾液,蒸發(fā)濃縮至無醇味且呈粘稠狀,真空干燥,粉碎并過80目篩,得提取物,計算提取物得率.得率(%)=提取物重量/藥材粗粉重量×100%.

    1.5.2 紫外指紋圖譜分析

    稱取0.05 g及己地上部分醇提取物,用75%乙醇溶解配制成1 mg·mL?1的樣品溶液.用75%乙醇進行空白校正,在以下光譜條件下用紫外分光光度計掃描樣品:掃描范圍為190~500 nm;掃描速 度為400 nm·min?1;采樣間隔為1.0 nm.

    1.5.3 急性毒性實驗

    實驗開始前,按照文獻中折算表確定劑量[6],最終確定大鼠日給藥量(及己地上部分醇提取物質量,g·kg?1)=成人日服量(3 g)×0.018(換算系數(shù))×醇提取物得率×倍數(shù)(DC低組:50倍;DC高組:100倍)×5,即得DC低組、DC高組劑量分別為1.58 g·kg?1、3.16 g·kg?1.選取2只大鼠灌胃給予高劑量的2.5倍(7.90 g·kg?1),在48 h內(nèi)觀察大鼠的形態(tài)變化及存活情況等.

    1.5.4 動物分組與給藥

    取24只雄性SD大鼠按隨機數(shù)表法隨機均分為:空白組(KB)、DC低組(50倍)、DC高組(100倍),每組8只.將提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制均勻后灌胃給予大鼠對應劑量,KB組給予相同量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,14天內(nèi)每日按時灌胃1次,于第15天處死.

    1.5.5 大鼠一般狀況的觀察及其臟器指數(shù)的計算

    實驗期間,每日定時監(jiān)測大鼠的飲食、活動,記錄皮毛、色澤等變化情況.每隔2日稱量一次大鼠體重.于第15天,用20%烏拉坦溶液按照5 mL·kg?1的劑量麻醉大鼠后摘除眼球取血,并頸椎脫臼處死后迅速解剖取出大鼠肺.用分析天平稱重,于?80℃保存?zhèn)溆貌⒂嬎闩K器指數(shù).臟器指數(shù)(%)=臟器重量/體重×100%.

    1.5.6 肺組織勻漿中T-SOD、MDA、GSH和CAT含量測定

    取出?80℃保存的肺組織,室溫復溫,剪下適宜大小稱重,置于手動勻漿器中,加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下手動勻漿,以12 000 rpm條件低溫離心15 min,收集上清液,分別按照試劑盒說明書來測定T?SOD、MDA、GSH和CAT的含量.

    1.5.7 肺組織病理學觀察

    取適量肺組織,用10%甲醛溶液固定,用脫水劑脫水,石蠟包埋,用切片機切片、于載玻片貼片、脫蠟復水,用蘇木素?伊紅(HE)染液染色后,置于光學顯微鏡下查看并評估各組肺組織病理學改變,并從以下三項進行病理學損傷評分[11]:①肺毛細血管充血、肺內(nèi)出血;②炎性細胞在血管壁及肺間隙集聚或浸潤;③肺泡壁增厚.每項有5個評分,其中無損傷為0分,損傷達觀察視野的25%為1分,損傷達觀察視野的50%為2分,損傷達觀察視野的75%為3分,整個視野彌漫性肺損傷為4分.取各項評分之和為總評分.由不了解本實驗設計的專業(yè)病理醫(yī)生進行肺損傷評分.

    1.5.8 免疫組化法檢測ICAM-1的表達水平

    將1.5.7步驟中制作的切片,經(jīng)脫蠟后依次于100%、95%、85%、75%和50%的酒精中復水、滅活酶、抗原熱修復、正常血清封閉、清洗、一抗4℃孵育過夜、二抗孵育1 h、滴加SABC、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片等,于顯微鏡下觀察拍照,用Image J統(tǒng)計得出陽性表達值并定量分析.

    1.5.9 Western blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白的表達情況

    取適量肺組織于EP管中,向管中加入裂解液(RIPA和PMSF比例為100∶1)于冰上研磨勻漿,在4℃下,以12 000 rpm條件用離心機離心20 min,取上清液為樣品,加上樣緩沖液(5×),于沸水中加熱變性.將蛋白用凝膠電泳進行分離,轉移至NC膜.用5%脫脂牛奶封閉,清洗后繼續(xù)4℃孵育一抗(β?actin、Nrf2、HO?1)過夜,然后孵育二抗1 h,加入現(xiàn)配的ECL顯影液曝光顯影,用Image J得出條帶的灰度值,取對應比值(目的蛋白/內(nèi)參灰度值)進行統(tǒng)計分析.

    1.5.10 統(tǒng)計學方法

    2 結果

    2.1 紫外指紋圖譜

    從樣品的全波長掃描光譜可以看出,及己地上部分醇提取物的主要吸收范圍為190~350 nm.及己地上部分醇提取物在292 nm、268 nm、266 nm、247 nm、235 nm、232 nm和190 nm處均有吸收峰,在可見光范圍內(nèi)沒有干擾.見圖1.

    圖1 及己地上部分醇提取物的紫外指紋圖譜

    2.2 急性毒性實驗結果

    在灌胃劑量高達7.90 g·kg?1時,未出現(xiàn)大鼠死亡的現(xiàn)象,這表明DC的LD50高于7.90 g·kg?1.因此,最終以1.58 g·kg?1、3.16 g·kg?1評估DC誘發(fā)大鼠肺毒性大小.

    2.3 對各組大鼠一般體征的影響

    KB組大鼠飲食正常,毛密、有光澤,活動狀態(tài)均正常,反應敏捷.DC低組大鼠皮毛無光澤,活動和飲食均略微減少,反應遲鈍;DC高組皮毛暗淡無光,有脫落,皮毛質感粗糙,飲食明顯減少,出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡的狀態(tài).

    2.4 對各組大鼠體重變化的影響

    給藥期間,KB組大鼠體重正常升高;與KB組相比,DC低組和DC高組體重變化率明顯降低(p<0.05或p<0.01),且DC高組降低程度更明顯,見圖2.

    圖2 各組大鼠體重變化率曲線

    2.5 對各組大鼠肺形態(tài)的影響

    KB組肉眼觀察可見肺表面呈淡粉紅色且十分光滑,觸摸比較后發(fā)現(xiàn)其具有良好的彈性,未見其他異常;DC低組肺表面局部有少量出血點,彈性尚可;DC高組肺表面有多個明顯的出血點,整個臟器呈深紅色,彈性遠不及KB組,邊緣有明顯鈍化,見圖3.

    圖3 各組大鼠肺形態(tài)

    2.6 對各組大鼠肺指數(shù)的影響

    連續(xù)灌胃給藥14天后,DC低組、DC高組的肺指數(shù)較KB組略微增加,無統(tǒng)計學意義(p<0.05),見圖4.

    圖4 及己不同部位醇提取物對大鼠肺指數(shù)的影響

    2.7 對各組大鼠肺勻漿指標T-SOD、MDA、GSH和CAT含量的影響

    與KB組相比,DC低組四個指標含量變化均不顯著(p>0.05);DC高組CAT水平較KB組顯著性降低(p<0.05).DC高組與KB組、DC低組相比,MDA水平極顯著性升高(p<0.01),GSH水平和CAT水平顯著性降低(p<0.05),見表1.

    表1 對不同組SD大鼠肺勻漿指標的影響(±s,n=8)

    表1 對不同組SD大鼠肺勻漿指標的影響(±s,n=8)

    注:與KB組相比,*表示p<0.05,**表示p<0.01;與DC低組相比,#表示p<0.05,##表示p<0.01.

    組別KB組DC低組DC高組T?SOD/(U·mg?1)98.84±1.34 96.25±1.11 83.33±1.53**##MDA/(nmol·mg?1)1.08±0.06 1.31±0.05 2.04±0.33**##GSH/(μmol·g?1)4.50±1.29 4.21±0.45 2.52±0.24*#CAT/(U·mg?1)4.31±0.39 4.08±0.26 3.67±0.18*

    2.8 對各組大鼠肺組織病理形態(tài)學的影響

    KB組肺泡組織結構完整,大小正常,未見炎細胞浸潤,肺泡腔未見擴大異常,間質無明顯水腫,未見明顯充血情況;DC低組在支氣管周圍有炎細胞浸潤,肺泡結構不規(guī)則,間質有出血現(xiàn)象,血管周圍出現(xiàn)脂肪變態(tài)反應;DC高組支氣管四周有明顯炎細胞浸潤,管壁纖維排列紊亂呈鋸齒狀增生,血管壁出現(xiàn)纖維淀粉樣變性,肺泡結構不規(guī)則,肺泡腔明顯縮小,肺泡壁增厚,有出血現(xiàn)象.DC高組較DC低組病理評分顯著升高(p<0.01),見圖5.

    圖5 各組大鼠肺組織HE染色(×200)和病理學評分

    2.9 對各組大鼠肺組織中ICAM-1陽性表達水平的影響

    當機體內(nèi)出現(xiàn)炎性癥狀時,ICAM?1以在細胞膜及細胞漿表達為主,鏡下觀察呈棕黃色顆粒.與KB組相比,DC高組、DC低組ICAM?1陽性表達極顯著性增多(p<0.01).與DC低組相比,DC高組ICAM?1陽性表達也極顯著性增加(p<0.01).見圖6.

    圖6 各組大鼠肺組織ICAM-1陽性表達(×200)及表達率

    2.10 對各組大鼠肺組織中Nrf2/HO-1蛋白表達的影響

    與KB組相比,DC低組HO?1蛋白表達量顯著性下降(p<0.05),Nrf2蛋白表達極顯著性下降(p<0.01),DC高組Nrf2和HO?1蛋白表達量均極顯著性下降(p<0.01).與DC低組相比,DC高組Nrf2和HO?1蛋白表達量極顯著性下降(p<0.01),見圖7.

    圖7 各組大鼠肺組織中HO-1/Nrf2表達

    3 討論與結論

    MDA可導致細胞異常壞死,具有細胞毒性[12],能反應細胞對自由基的清除程度與細胞膜脂質過氧化損傷的程度[13].GSH是機體抗氧化劑和細胞保護劑,可清除自由基的同時抗脂質過氧化損傷[14].SOD可轉化超氧自由基為過氧化物,過氧化物進一步被CAT分解,形成抗氧化防御系統(tǒng),起到減輕損傷的作用[15].當SOD含量降低時,細胞清除自由基能力減弱,此時細胞處于過氧化損傷狀態(tài)[16].CAT和SOD為機體內(nèi)的保護酶,其含量變化常被用作判斷損傷程度的指標[17].本實驗中,及己地上部分醇提取物能使肺勻漿中SOD、GSH和CAT含量明顯下降,MDA含量明顯上升,且DC高組比DC低組變化程度更大.可初步判斷及己地上部分醇提取物引起的肺毒性與氧化應激有關,且DC高組影響的水平要高于DC低組,這可能和劑量有一定的相關性.

    ICAM?1可輔助機體進行免疫防御調(diào)整,促進炎癥部位的黏連,使白細胞到達炎癥部位,增強炎癥細胞與內(nèi)皮細胞的黏附作用.在肺組織有炎性癥狀時,其含量明顯增加,是肺組織細胞是否受損的判斷指標之一[18].本實驗中,及己地上部分醇提取物能上調(diào)ICAM?1的陽性表達,且DC高組上調(diào)ICAM?1的表達比DC低組更明顯,說明DC高組的肺毒性要高于DC低組.

    Nrf2/HO?1參與機體抗氧化的調(diào)整,在生理條件下,Nrf2以結合物形式存在,沒有活性;但受到氧化應激刺激,Nrf2解離且核轉位增多,啟動多種抗氧化基因的表達,增強抗氧化作用,并減輕自由基所導致的臟器損傷[19].HO?1具有抗氧化、消炎、抑制細胞凋亡等作用,在機體受到有害刺激時起到保護細胞免受損傷的作用[20].當機體受到氧化應激等刺激時會增強HO?1蛋白表達水平來保護自身,但長時間受有毒物質刺激時,機體內(nèi)HO?1表達水平會降低[21].本實驗中,與KB組相比,DC高組、DC低組Nrf2、HO?1蛋白表達量明顯下降,且DC高組下降更明顯,表明及己DC高組、DC低組均給大鼠肺組織造成一定程度的氧化應激損傷,其中DC高組肺毒性尤為突出.

    以上研究結果表明,及己地上部分醇提取物呈劑量依賴性地激發(fā)氧化應激,調(diào)控Nrf2/HO?1信號通路,導致肺組織損傷,表現(xiàn)為肺組織中的ICAM?1陽性表達升高.目前對及己根、莖、葉的醇提取物已進行體內(nèi)抗炎作用及其對大鼠心、肝、肺、腎毒性的比較研究,結果發(fā)現(xiàn),其中及己根的醇提取物毒性最小且抗炎效果最好[2,4].

    綜上可知,及己的地上部分不是較好的用藥部位,及己根才是較好的用藥部位,可以作為進一步開發(fā)研究的目標,有望從中提取出單體抗炎成分,為及己的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù).

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