LINC01296/miR-1255b-5p促進非小細胞肺癌進展的研究

夏道韞，許琳楓，柴彬淑，郭 靜，孫強玲，李艷利

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。最新的癌癥數(shù)據(jù)分析顯示，肺癌的發(fā)病率在男性中僅次于前列腺癌，在女性中僅次于乳腺癌[2]。肺癌可以分為兩種，分別是小細胞肺癌（small cell lung can-cer，SCLC）和非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 約占肺癌總數(shù) 85%[3]。而NSCLC 又可以分為肺腺癌、肺鱗癌和大細胞癌[4]。NSCLC的早期癥狀不明顯，目前的診斷手段也不成熟，導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時已是晚期。此外，NSCLC的復(fù)發(fā)率較高，患者5 年生存率低于15%[2]。因此，對NSCLC診斷以及治療靶點的研究迫在眉睫。

長鏈非編碼 RNA（long non?coding RNA，lncRNA）是一種轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸非編碼RNA，。lncRNA具有多種生物學(xué)功能，如基因表達、表觀遺傳以及染色體裝配等[5-7]。隨著對lncRNA 在細胞生物學(xué)中功能的深入研究，大量臨床觀察和實驗結(jié)果顯示，許多l(xiāng)ncRNA表現(xiàn)出在特異性細胞及組織中存在差異表達，這些表達及功能異常的lncRNA可以通過多種途徑調(diào)節(jié)DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和作為miRNA的前體，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，并且主要體現(xiàn)在多種腫瘤疾病上，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8-10]。通過生物信息學(xué)分析顯示，發(fā)現(xiàn)了14個差異表達的lncRNAs，其中LINC01296 差異表達較為顯著[11]。因此，本研究旨在分析LINC01296 在體內(nèi)和體外對NSCLC 的作用及與miR?1255b?5p的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 患者樣本 選取上海交通大學(xué)附屬上海胸科醫(yī)院的肺癌患者樣本，樣本采集于2018 年，樣本數(shù)為40 例，凍存于?80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均對本次研究知情并簽署知情同意書（倫理號：IS2112）。

1.1.2 細胞系 本研究所用到的細胞系包括6 種NSCLC 細胞系（H1299、A549、PC?9、HCC827、H1975和95?D），人胚腎細胞系（HEK?293T）和人肺上皮細胞系（BEAS?2B）。其中H1299 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，其他的細胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 NSCLC細胞培養(yǎng) 按照ATCC提供的細胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)：A549、PC?9、HEK?293T 和 BEAS?2B 細胞使用DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）進行培養(yǎng)；而H1299、HCC827、H1975 和 95?D 細胞則使用 RPMI培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），并在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（Gibco 公司，美國）。細胞放置在環(huán)境為37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 qRT?PCR 檢測 LINC01296 的表達 本實驗使用Trizol 試劑，并參照試劑說明書的標(biāo)準(zhǔn)方法提取NSCLC細胞以及患者樣本RNA，并使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 的試劑盒（TaKaRa公司，日本）進行l(wèi)ncRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2μL cDNA作為模板，SYBR?PrimeScriptTMⅡ試劑盒產(chǎn)品進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time?polymerase chain reaction，qRT ? PCR）檢 測LINC01296 的表達水平，共 10 μL qRT?PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，擴增40個循環(huán)，采用2?ΔΔCT相對定量法進行分析與比較。

1.2.3 shRNA 載體構(gòu)建 首先在網(wǎng)站上設(shè)計shRNA 序列，每一對包含正義和反義寡核苷酸鏈互補序列。配制shRNA反應(yīng)體系，以獲得退火產(chǎn)物。之后利用T4 DNA 連接酶催化退火產(chǎn)物連接到pLKO.1 載體（實驗室儲存質(zhì)粒）上，4 ℃過夜連接。取2 μL 連接產(chǎn)物和25 μL DH5α 進行轉(zhuǎn)化，以獲得大量目的質(zhì)粒。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建 本實驗所用的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株包括穩(wěn)定敲低LINC01296 基因的細胞株。培養(yǎng)293T 細胞并使其保持良好的生長狀態(tài)，采用psPAX2 和pMD2G 共轉(zhuǎn)染的方法獲得病毒溶液。在轉(zhuǎn)染的24、48、72 h 后分別收集細胞培養(yǎng)基即病毒液，收集的病毒液放在4 ℃離心機中4 000 r 離心10 min。用0.45 μm濾器過濾得到病毒液。將病毒液與培養(yǎng)基等比例混合，加入到密度為70%左右的細胞中進行感染，同時加入10 μg 聚凝胺（polybrene）促進感染。最后通過加藥篩選或流式細胞分選得到成功穩(wěn)轉(zhuǎn)的細胞。

1.2.5 細胞表型實驗

1.2.5.1 CCK?8比色法檢測細胞增殖 取NSCLC 細胞，在96 孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種1 500 個細胞，設(shè)置4 個復(fù)孔，在細胞周圍的孔中加入適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)以防培養(yǎng)基蒸發(fā)。在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后細胞貼壁，此時每孔加入100 μL 的5%細胞計數(shù)試劑盒?8（cell counting kit?8，CCK?8）試劑（由無血清培養(yǎng)基配制），孵育 2 h 后吸取 95 μL 液體放入 96 孔酶標(biāo)板中，在450 nm 波長處測OD 值，由于此時細胞尚未分裂，此時細胞密度可作為原始密度。此后繼續(xù)檢測 24、48、72、96 h時的 OD 值。

1.2.5.2 細胞克隆形成實驗 取NSCLC細胞，6孔板中每孔鋪板300~600個細胞，在37 ℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，細胞形成菌落。加入200μL無水甲醇固定細胞15 min。吸去無水甲醇，加入200μL草酸銨結(jié)晶紫溶液，靜置染色15 min。吸除染液，用蒸餾水洗滌至無紫色為止，之后拍照計數(shù)，處理數(shù)據(jù)。

1.2.5.3 劃痕試驗 取NSCLC 細胞，鋪30%~40%密度的細胞于12 孔板中，每個樣品2 個復(fù)孔，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞長滿培養(yǎng)板底部時便可實施劃痕實驗。劃痕之后，用PBS清洗細胞，確保懸浮的細胞被沖洗干凈。用封口膜包裹好培養(yǎng)板，拍照（0 h位置），24 h 后第2次拍照。對比兩次拍照的劃痕大小處理數(shù)據(jù)，按公式細胞遷移率=（0 h 時劃痕寬度-24 h時劃痕寬度）/0 h 時劃痕寬度進行計算。

1.2.5.4 FITC?Annexin?V 試劑盒檢測細胞凋亡 取NSCLC細胞，12孔板中鋪細胞培養(yǎng)，密度達到80%~90%時，用超凈臺紫外光照誘導(dǎo)處理細胞2 h。用無EDTA的胰酶消化收集細胞，每個樣品加入50μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer），分配好空白和單染對照（用以調(diào)整熒光補償），剩余的全部加入2.5μL Annexin V?FITC 和 2.5 μL PI，室溫避光孵育 15 min 以上，200目濾膜過濾后，將樣品裝入流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分率。

1.3 動物實驗 裸鼠10 只（BALB/c?Nude裸鼠，6 周齡雌性）購自上海斯萊克實驗動物有限公司。在特定的無病原環(huán)境中飼養(yǎng)7 d后，隨機分為兩組，每組5 只，分別為對照組和實驗組。在對照組中，每只小鼠右腹部皮下和小鼠尾部靜脈注射A549?pLKO.1（低表達 LINC01296 的A549）細胞個數(shù)分別為5×106個，2.5×106個。實驗組小鼠用同樣的方式注射 A549?shLINC01296?2 細胞。使用游標(biāo)卡尺每周測量一次皮下腫瘤的長和寬，計算瘤體的大小，8 周后處死小鼠。計算皮下腫瘤體積、重量以及肺結(jié)節(jié)數(shù)。動物實驗遵循上海大學(xué)動物保護和使用委員會的規(guī)定。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?本實驗采用pRL和pGL3 兩種質(zhì)粒。將含有miR?1255b?5p結(jié)合位點的LINC01296 序列 插入 pGL3 載 體(pGL3 ?LINC01296 WT)的Xba I/EcoR I位點，構(gòu)建pGL3?LINC01296 WT報告載體。另外構(gòu)建突變體LINC01296 (pGL3?LINC01296 Mut)。將pGL3?LINC01296 WT或pGL3?LINC01296 Mut 報告載體、海腎螢光素酶報告載體(pRL)和miR?1255b?5p模擬物共轉(zhuǎn)染到293T細胞中。使用Invitrogen 的Lipofectamine 2 000進行細胞轉(zhuǎn)染。48 h 后用 Promega 公司的 Dual?Luciferase Reporter Assay System 進行雙熒光檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件，完成數(shù)據(jù)分析和繪制統(tǒng)計圖表，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用雙t檢驗，為了保證實驗數(shù)據(jù)的真實和準(zhǔn)確，每個實驗均有3 次獨立的生物學(xué)重復(fù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01296 在NSCLC 中的表達 本研究首先通過在線數(shù)據(jù)庫（http://gepia2.cancer-pku.cn/#degenes）分析LINC01296的表達水平，發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，LINC01296在NSCLC中的表達顯著上調(diào)（上調(diào)約為 5 倍）。進一步通過 qRT?PCR 檢測LINC01296 在 6 種 NSCLC 細胞系（H1299、A549、HCC827、H1975、PC?9 和95?D）和正常人肺上皮細胞BEAS?2B 中的表達水平（圖 1a）。與 BEAS?2B 相比，LINC01296 在 6 種 NSCLC 細胞系中的表達水平均是上調(diào)的。 為了進一步驗證實驗結(jié)論，選取了患者樣本，對樣本中的LINC01296的表達水平進行檢測(圖1b)。結(jié)果顯示，與正常組織相比，LINC01296在癌癥組織中顯著高表達。

圖1 LINC01296在癌細胞以及腫瘤組織中表達

2.2 敲低LINC01296對NSCLC細胞生長、遷移的影響 用CCK?8法和克隆形成實驗研究LINC01296基因敲低對NSCLC 細胞系體外增殖的影響。結(jié)果表明，與對照組細胞A549?pLKO.1和H1299?pLKO.1比較，A549?shLINC01296?2 和 H1299?shLINC01296?2的細胞增殖和克隆形成能力均受到顯著抑制（圖2）。

圖2 敲低LINC01296基因?qū)σ种芅SCLC細胞生長的影響a~b：CCK?8 法檢測敲低 LINC01296 基因，與未敲低相比，H1299 和A549 細胞增殖受到抑制；c~d：克隆形成實驗敲低LINC01296基因，與未敲低相比，H1299和A549細胞增殖能力顯著下降，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

進一步采用劃痕實驗研究兩種NSCLC 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的遷移能力。與對照組細胞A549?pLKO.1 和H1299?pLKO.1 比較 LINC01296 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞A549?shLINC01296?2 和 H1299 ?shLINC01296?2 的遷移能力顯著降低（圖3）。

圖3 敲低LINC01296基因?qū)SCLC細胞遷移的影響

2.3 敲低LINC01296 對體內(nèi)瘤體生長和轉(zhuǎn)移的影響 以上的體外實驗均證明LINC01296影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展。為證明本研究的結(jié)論，進行了動物實驗。為符合動物保護倫理，將其中2 只裸鼠安樂死，對其余3 只進行分析處理。每周測量皮下腫瘤大?。▓D4a），并計算最終皮下腫瘤的重量（圖4c），圖b 是8 周后小鼠瘤體圖像。與對照組相比，實驗組的腫瘤大小和重量增加得更慢（圖4a、c）

圖4 LINC01296水平的減少對體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響

2.4 LINC01296 通過 miR?1255b?5p 海綿吸附作用對肺癌的影響 為了進一步研究LINC01296 對NSCLC 調(diào)控的分子機制，首先通過StarBase(starbase.sysu.edu.cn/)、TargetScan (targetscan.org/vert72)以及miRanda (microrna. org) 預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測LINC01296 靶向結(jié)合的microRNA，然后取交集，最終 篩 選 出 miR?1255b?5p。 miR?1255b?5p 與LINC01296 上的靶序列互補配對的模式圖（圖5a）。實驗結(jié)果表明，miR?1255b?5p 直接靶向LINC01296的種子序列對LINC01296 發(fā)揮抑制作用。為了驗證 LINC01296 直 接 靶 向 miR?1255b?5p，先 將LINC01296野生型(LINC01296?WT)的結(jié)合位點連接到攜帶pGL3載體的熒光素酶開放閱讀框的下游，形成pGL3?LINC01296 ? WT。 pGL3?LINC01296 ? WT 和miR?1255b?5p mimic共轉(zhuǎn)染后，與對照組相比，293T細胞中的熒光素酶活性顯著降低，而在突變體組中觀察到相反的結(jié)果(圖 5a)。此外，qRT?PCR 結(jié)果顯示，LINC01296敲除的穩(wěn)定細胞中miR?1255b?5p 的表達顯著上調(diào)(圖 5b?c)。綜上，說明 LINC01296 能起miR?1255b?5p海綿作用。

圖5 LINC01296吸附miR?1255b?5p對其表達的影響

2.5 LINC01296 與 miR?1255b?5p 的表達關(guān)系 為了進一步研究 LINC01296 與 miR?1255b?5p 的相關(guān)性，采用 qRT?PCR 檢測 NSCLC 組織中 miR?1255b?5p 的表達水平(圖6a)。與鄰近組織相比，miR?1255b?5p 的表達下調(diào)，而 LINC01296 在癌癥樣本中顯著高表達（圖1b）。結(jié)果表明，miR?1255b?5p 隨著腫瘤的發(fā)展而降低，其表達趨勢與LINC01296呈負(fù)相關(guān)(圖 6b)。

圖6 LINC01296與miR?1255b?5p的表達關(guān)系

3 討論

本研究旨在探討LINC01296在NSCLC中的作用機制。實驗結(jié)果顯示LINC01296 在NSCLC 中高表達。并且，敲低LINC0129會抑制NSCLC細胞生長、遷移。小鼠體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)LINC01296低表達對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。此外，LINC01296通過miR?1255b?5p海綿吸附作用，促進了肺癌的發(fā)生發(fā)展，二者的表達水平也呈負(fù)相關(guān)。

近年來，LINC01296 在結(jié)直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、膽管癌（CCA）和骨肉瘤中的作用已被研究[11,13-15]。生物信息學(xué)分析結(jié)果和生存曲線顯示，LINC01296 的高表達與預(yù)后不良相關(guān)[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，LINC01296 在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，并通過靶向CARD11 基因和NF?κB 途徑來抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移[15]。LINC01296可能靶向細胞周期蛋白D1，進而促進骨肉瘤的細胞增殖、轉(zhuǎn)移和細胞周期進展[16]。此外，在膀胱癌中轉(zhuǎn)染siLINC01296后，膀胱癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移減少[16]。另外，研究還發(fā) 現(xiàn) microRNA?5095 在 NSCLC 和 CCA 中 與LINC01296 結(jié)合的能力很強[13,17]。此外，在 CCA 中，高水平的LINC01296使MYCN的表達被上調(diào)。

LINC01296在NSCLC 中的作用機制尚不清楚，其在基因表達中的調(diào)控機制也有待進一步研究。另外，miR?1255b?5p 具有抗腫瘤作用，并參與調(diào)節(jié)hTERT 介導(dǎo)的上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。在糖尿病腎病患者中，miR?1255b?5p 表達顯著上調(diào)，有望成為診斷糖尿病腎病的生物標(biāo)志物[19]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)一些microRNA，如miR?221 的表達受到一些lncRNA 的調(diào)控，并且這些lncRNA 已經(jīng)被證實與NSCLC的發(fā)生與發(fā)展有著重要關(guān)系[20]。

本實驗結(jié)果為LINC01296 可作為NSCLC 的促癌分子，其作用機制是通過抑制miR?1255b?5p的表達水平，促進了NSCLC 的發(fā)展。后續(xù)將繼續(xù)研究LINC01296/miR?1255b?5p在NSCLC中的作用機理，如 LINC01296/miR?1255b?5p 的信號通路、miR?1255b?5p 作用的靶基因、LINC01296 表達的調(diào)控因子等。這些機制的闡明將為NSCLC 的診斷和藥物開發(fā)的應(yīng)用提供光明的前景。