CEP170在肝癌中的表達(dá)及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

劉 靜，牛亞楠，孫力超

肝癌是嚴(yán)重危害我國人民健康的常見惡性腫瘤，全球每年約50%新發(fā)肝癌病例來自中國[1]。最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，目前我國肝癌已躍居癌癥發(fā)病率第 5 位，死亡率第 2 位[2]。在過去的 20 年中，與肝癌相關(guān)的死亡率仍在繼續(xù)增加。肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝臟惡性腫瘤，占肝癌的90%以上。肝癌具有惡性程度高，病情進(jìn)展快，生存期短等特點(diǎn)。伴門靜脈癌栓的肝癌患者發(fā)生率為44.0% ~62.2% ,腫瘤細(xì)胞從門靜脈的二級(jí)分支生長到一級(jí)分支平均僅需8.5 d，而從一級(jí)分支蔓延至主干平均僅需11.5 d，并可引起門靜脈高壓、黃疸、腹水等嚴(yán)重并發(fā)癥[3-4]?；诟伟┎涣碱A(yù)后及現(xiàn)狀，急需探索新的治療靶點(diǎn)。

中心體相關(guān)蛋白（centrosomal protein，CEP）調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的起始并調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，其家族成員表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中心體錯(cuò)誤組裝，染色體組不穩(wěn)定，會(huì)導(dǎo)致有絲分裂紊亂，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[5]。研究者對(duì)中心體家族蛋白質(zhì)組信息進(jìn)行了系統(tǒng)分析，揭示其家族成員在細(xì)胞分裂中的重要作用[6]。CEP表達(dá)異常與肝癌密切相關(guān)，前期研究提示，CEP 家族成員CEP55 通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，CEP350 的低表達(dá)也與肝癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。CEP 家族分子參與調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

CEP170 由 Giulia 等[9]在 2004 年發(fā)現(xiàn)，該基因定位于染色體1q43，包含23 個(gè)外顯子，編碼170 kDa大小的蛋白。大多數(shù)已知的CEP 都含有大量盤繞線圈區(qū)域，相比之下CEP170 僅包含短線圈。在其N 末端還包含一個(gè)特定的 FHA（forkhead?associated）結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域通常與磷酸化肽段相識(shí)別，并參與 DNA 損傷修復(fù)途徑[10-12]。CEP170 在細(xì)胞間期與中心體結(jié)合，分裂期與紡錘體相結(jié)合，在細(xì)胞的有絲分裂中發(fā)揮著重要作用，而有絲分裂正是決定細(xì)胞增殖的關(guān)鍵點(diǎn)。目前，關(guān)于CEP170 與肝癌的關(guān)系尚無報(bào)道，本研究將分析CEP170 在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：SP?9000），CEP170 抗體購自亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：ABP50950）。人肝癌細(xì)胞Huh?7 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞生物與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，DMEM 培養(yǎng)基購自北京細(xì)工生物科技有限公司。Lipofectamine 2000 購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司（貨號(hào)：11668019），CCK?8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)（貨號(hào)：CK?04）。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司（貨號(hào)：KGA512）。特異性 siRNA（CEP170 siRNA1：5′?GGCGCTTTCCTACTGATTATG?3′，CEP170 siRNA2：5′?GCTCTGCTTCAGTAAATTCAA?3′）購自蘇州吉碼制藥技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 表達(dá)差異分析 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)來自臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)合會(huì)（clinical proteomic tumor analysis consortium，CPTAC )數(shù)據(jù)庫（https://proteomics.cancer.gov/programs/cptac）中收錄的研究隊(duì)列，其中包括159例中國HCC 患者腫瘤組織及配對(duì)正常組織的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和臨床信息，有臨床預(yù)后信息的病例150例[13]。Human Protein Atlas蛋白表達(dá)圖 譜 數(shù) 據(jù) 庫（http://www. proteinatlas. org/) 觀 察CEP170在HCC中的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床樣本信息來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/about?nci/organization/ccg/research/structural?genomics/tcga)，其中正常組織50例，癌組織371例。在線數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站cBioPortal（http://www.cbioportal.org/)分析CEP170在350例肝癌組織中的DNA拷貝數(shù)變異情況，利用R包limma進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。

1.2.2 預(yù)后分析 以基因表達(dá)值中位數(shù)為臨界值將患者分為CEP170 高表達(dá)組和低表達(dá)組。應(yīng)用Kaplan?Meier 統(tǒng)計(jì)分析法，survival 包進(jìn)行生存分析。timeROC 包繪制ROC 曲線進(jìn)行生存預(yù)測(cè)。結(jié)合與肝癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素及多因素COX 回歸分析，探究CEP170 是否為影響患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 在72 ℃條件下將人肝癌石蠟組織切片脫蠟1 h，二甲苯浸泡，酒精水化，EDTA修復(fù)抗原，一抗孵育過夜。在37 ℃下使用中杉金橋通用型二抗孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素染色，溫水返藍(lán)，酒精浸泡，二甲苯脫水，中性樹脂封片后烘干，掃描拍照。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 人肝癌細(xì)胞系Huh?7用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)接種于六孔板，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染 siRNA。轉(zhuǎn)染 24 h 后，胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，按照2×103個(gè)/孔接種細(xì)胞，設(shè)6 個(gè)平行孔，接種5 塊96 孔板。每隔24 h 檢測(cè)一塊96 孔板的450 nm (OD450)吸光值，繪制細(xì)胞生長曲線。按照500 個(gè)/孔接種六孔板培養(yǎng)兩周，冰甲醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)在50個(gè)以上的克隆。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液逐滴加入到70%預(yù)冷無水乙醇中，4 ℃固定3 h以上。離心去固定液，加入配置好的RNAse A:PI工作液染色。30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0 軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。Kaplan?Meier 統(tǒng)計(jì)分析方法預(yù)測(cè)蛋白表達(dá)與患者預(yù)后生存關(guān)系。單因素及多因素Cox回歸分析不同因素與患者生存期的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEP170 在HCC 組織中蛋白表達(dá)與預(yù)后關(guān)系通過limma 包對(duì)CPTAC 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析顯示HCC組織中CEP170蛋白表達(dá)量較正常組織顯著升高（P<0.001,圖1A）。從Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中的IHC 結(jié)果可見CEP170 在HCC 中表達(dá)量升高（圖1B）。Kaplan?Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)CEP170 高表達(dá)與患者預(yù)后不良正相關(guān)（P=0.002，圖1C），ROC曲線分析CEP170 對(duì)患者生存的預(yù)測(cè)效應(yīng)，曲線下面積AUC值均大于0.7（圖1D），說明CEP170表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高。COX 單因素及多因素回歸分析結(jié)果顯示，CEP170 高表達(dá)為HCC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(圖2A、2B，P<0.001)，從而可作為HCC患者生存風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)潛在的分子標(biāo)志物。

圖1 CEP170在HCC中的表達(dá)與患者預(yù)后情況

圖2 HCC不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素

2.2 CEP170 在 HCC 組織中 mRNA 表達(dá)及預(yù)后影響 通過UALCAN 網(wǎng)站在線分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中HCC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，HCC 組織中CEP170 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平較正常組織顯著升高（P<0.001，圖3A），HCC 組織中mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平升高與患者預(yù)后不良正相關(guān)（P<0.001，圖3B）。通過ciBioPotal數(shù)據(jù)庫在線分析CEP170 在HCC 組織中DNA 拷貝數(shù)變異情況，發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增頻率為6%（21/350），突變頻率為1.43%（5/350），圖3C。結(jié)果提示DNA 拷貝數(shù)擴(kuò)增是CEP170基因轉(zhuǎn)錄水平升高的可能原因。

圖3 CEP170在HCC組織中mRNA表達(dá)及預(yù)后影響

2.3 敲降CEP170 表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響通過IHC 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行組織驗(yàn)證，可見癌組織中CEP170 表達(dá)量高于正常組織（圖4A）。利用特異性 siRNA1 及 siRNA2 敲降肝癌細(xì)胞株 Huh?7 中CEP170 表達(dá)（圖4B），結(jié)果顯示細(xì)胞增殖及克隆形成能力均顯著降低（P<0.001，圖4C、4D）。

2.4 敲降CEP170 表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響為了探究CEP170是否影響肝癌細(xì)胞周期，本研究利用特異性siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株Huh?7 48 h后流式分析結(jié)果顯示，敲降CEP170的表達(dá)Huh?7細(xì)胞發(fā)生G0/G1周期阻滯，且具有顯著差異（P<0.001,圖5）。

圖5 敲降CEP170表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響

3 討論

肝癌預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高，病情進(jìn)展迅速。2015年我國新發(fā)肝癌病例8.9 萬余人，死亡7.8 萬余人，肝癌死亡病例占全部癌癥死亡的13.97%。探究其發(fā)病機(jī)理及相關(guān)影響因素，尋找更為有效的治療方法仍亟待解決。目前，利用生物信息學(xué)手段，通過分析相關(guān)基因在臨床上的表達(dá)及意義，為尋找相關(guān)治療靶點(diǎn)提供了新途徑[14-15]。

中心體是細(xì)胞中重要的無膜細(xì)胞器，參與細(xì)胞的有絲分裂，它的行為和調(diào)控由一系列執(zhí)行細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)完成，保證遺傳物質(zhì)能夠精確、有序和完整地傳遞到子代細(xì)胞中[16-17]。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)CEP家族表達(dá)異常與腫瘤關(guān)系密切，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，CEP家族成員通過多種形式調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CEP55 通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的糖代謝、增殖和凋亡，同時(shí)CEP55 的過表達(dá)增強(qiáng)了FOXM1 和MMPs 的表達(dá)并過度激活NF?κB途徑，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤及胰腺癌的發(fā)生產(chǎn)生促進(jìn)作用[18-20]。通過二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)121例前列腺癌患者的94 個(gè)與癌癥易感性相關(guān)的基因，證實(shí)CEP57 與前列腺癌發(fā)病正相關(guān)[21-22]；CEP135 蛋白失調(diào)促進(jìn)了中心體的復(fù)制異常，并導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中的染色體分離異常[23]。 既往關(guān)于CEP170的研究主要集中于其生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能探索[24-26]，與腫瘤的相關(guān)研究較少見，本研究針對(duì)這一新的目標(biāo)分子，逐層開展研究。

CPTAC 數(shù)據(jù)庫整合了蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)信息，為從蛋白質(zhì)層面進(jìn)行探究提供了豐富的臨床數(shù)據(jù)資源。本研究的優(yōu)勢(shì)之處在于首先利用CPTAC 中HCC蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，從功能蛋白的表達(dá)入手，探索與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)的基因表達(dá)差異。進(jìn)一步對(duì)CEP170 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)得到了一致的結(jié)論。接下來的研究中還發(fā)現(xiàn)，在基因組數(shù)據(jù)中肝癌組織CEP170 基因DNA 拷貝數(shù)發(fā)生了高頻次的擴(kuò)增，這種異常擴(kuò)增是CEP170 mRNA 水平升高的可能原因。由此可以初步假設(shè)，由于CEP170 基因在HCC 中異常擴(kuò)增導(dǎo)致CEP170 在HCC 中高表達(dá)，且這種高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。為此，本研究又進(jìn)行了一系列的體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。組織驗(yàn)證中得到和數(shù)據(jù)分析中相同的結(jié)論，CEP170在肝癌組織中表達(dá)量升高。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特異性敲降CEP170 表達(dá)能夠顯著降低肝癌細(xì)胞Huh?7 的增殖能力，細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1 期阻滯，驗(yàn)證了數(shù)據(jù)分析結(jié)果，該基因在DNA 擴(kuò)增期發(fā)揮作用。本研究通過多組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)CEP170基因在肝癌中的作用進(jìn)行了初步探究，研究發(fā)現(xiàn)CEP170 可能通過影響細(xì)胞周期促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，本研究結(jié)果為闡明CEP170促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為肝癌個(gè)體化診療提供候選分子靶點(diǎn)。同時(shí)，利用蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行研究得到的結(jié)果，較基因組研究提供了更加直接的證據(jù)。但對(duì)于CEP170 基因在HCC 中發(fā)生異常擴(kuò)增的原因，以及CEP170蛋白異常表達(dá)如何影響預(yù)后生存等問題尚待解決。下一步可繼續(xù)擴(kuò)大組織的樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，并針對(duì)CEP170下游效應(yīng)分子、相關(guān)分子通路等內(nèi)容繼續(xù)開展研究。綜上所述，CEP170 在肝癌組織中異常高表達(dá)，降低CEP170 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖且細(xì)胞發(fā)生G0/G1 期阻滯，CEP170 可能是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。