下調(diào)Lgr5表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成相關(guān)因子的影響

路明，陳哲

(1.吉林市中心醫(yī)院胃腸外科，吉林 吉林 132001；2. 吉林市人民醫(yī)院口腔科)

結(jié)腸癌(Colon cancer, CC)是世界上最普遍的惡性腫瘤之一，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因，超過50%的CC相關(guān)死亡率是由于轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到肝臟造成的[1-2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)過程，癌細(xì)胞EMT與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)是EMT的重要指標(biāo)[3]。富含亮氨酸重復(fù)序列G-蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)是癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSCs)上一種表面標(biāo)記物，是一種7次α螺旋跨膜糖蛋白激素受體，在人大腦、胃腸道、乳腺及毛囊等處都有表達(dá)，在小腸和結(jié)腸隱窩基底柱狀上皮細(xì)胞和胃黏膜腺體頸部細(xì)胞中表現(xiàn)出特異的干細(xì)胞活性，因而，Lgr5可以作為結(jié)腸和小腸干細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Lgr5在多種癌組織中高表達(dá)，如卵巢癌、肝癌和結(jié)腸癌中[4-6]，同時發(fā)現(xiàn)Lgr5在腸黏膜組織不同病理情況下(正常黏膜組織、炎性增生性息肉、癌組織)表達(dá)水平不同，表明Lgr5同時可作為結(jié)腸癌預(yù)測的特異性指標(biāo)[7]。本文旨在闡明Lgr5對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響，并從EMT和血管生成方面研究Lgr5促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲遷移的可能機(jī)制，為結(jié)腸癌細(xì)胞的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞

人正常腸上皮細(xì)胞NCM460和人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29, SW620, LoVo)均購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品與試劑

轉(zhuǎn)染試劑盒、Lip 2000試劑盒和引物購自上海吉瑪基因有限責(zé)任公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自美國賽默飛有限公司；Lgr5、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、β-actin及二抗(兔/鼠)均購于上海艾博抗有限公司；ELISA試劑(VEGF、bFGF)盒購自南京建成生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本來源

收集吉林市中心醫(yī)院因其他疾病切除的正常結(jié)直腸黏膜組織及結(jié)腸癌組織，所有患者術(shù)前均未接受內(nèi)分泌、靶向或放化療等輔助治療。所有患者均簽署知情同意書，實驗方案由吉林市中心醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常腸上皮細(xì)胞NCM460和人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29、SW620、LoVo)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組

轉(zhuǎn)染對象為LoVo細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說明書對LoVo細(xì)胞中Lgr5進(jìn)行下調(diào)，實驗按照如下分組：對照組(只轉(zhuǎn)染Lip 2000)、si-NC組(轉(zhuǎn)染Lip2000和無關(guān)序列)和si-Lgr5組(轉(zhuǎn)染Lip2000和si-Lgr5序列)，轉(zhuǎn)染8 h，換成10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中在37 °C、5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 總RNA提取及實時熒光定量PCR檢測mRNA的相對表達(dá)量

使用TRizol試劑從人正常腸黏膜細(xì)胞NCM460、人結(jié)腸癌(HT-29、SW620、LoVo)和各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中提取總RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA模板；使用熒光定量PCR以檢測各組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平。 RT-PCR條件：94℃，5 min(初始變性)，40個循環(huán)的變性(94℃，30 s)，退火(55℃，30 s)，延伸(72℃，30 s) ， 72℃放置5 min(最終延伸)。引物序列如下表，實驗重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞分組同1.2.3，將轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞以每孔30×104個重新接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁，使用鋼尺和無菌一次性黃色槍頭將細(xì)胞沿直線劃傷，0 h記錄各組劃痕寬度，24 h再次記錄劃痕寬度，遷移抑制率(%)=(1-si-Lgr5組細(xì)胞劃痕寬度/si-NC組細(xì)胞劃痕寬度)×100 %，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲能力

細(xì)胞分組同1.2.3，每孔鋪60 μL基質(zhì)膠，在培養(yǎng)箱中凝固1 h，取轉(zhuǎn)染24 h對照組、si-NC組、si-Lgr5組細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，使用無血清培養(yǎng)基以每孔1×104個重懸于小室中。于37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h；取出小室；PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min；PBS漂多余染料，電子顯微鏡下計算透膜細(xì)胞數(shù)。侵襲抑制率(%)=(1-si-Lgr5組細(xì)胞侵襲移個數(shù)/si-NC組細(xì)胞侵襲個數(shù))×100 %，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法測定下調(diào)LoVo細(xì)胞Lgr5表達(dá)后血管生成相關(guān)因子VEGF、bFGF含量

細(xì)胞分組同1.2.3，將各組細(xì)胞調(diào)整濃度為1×104個/孔接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄上清，1% BSA-PBS輕柔洗板一次，每孔加入200μL預(yù)冷的0.025%戊二醛靜置15 min，PBS洗3次，每孔加入200μL 1% BSA-PBS，37℃下孵育2 h，然后進(jìn)行包被和封閉；加入一抗，37℃溫浴1 h；加入二抗，37℃溫浴1 h；甩掉板上的液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板(向每個孔中加入350 μL洗滌液)，并除去水滴，重復(fù)洗滌5次。向每個孔中加入100 μL顯色底物，輕輕混合10 s，37℃溫浴20 min。向每個孔中添加100μL終止液，輕輕混合30s，并在30 min內(nèi)讀取450 nm處的OD值，實驗重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot檢測Lgr5及EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)

將各組細(xì)胞裂解后提取蛋白，使用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，各組取等量蛋白樣品電泳，PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉4 h，一抗(Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Lgr5、β-actin)按1∶2000稀釋，置于4℃條件下?lián)u床上搖晃過夜。TPBS 溶液漂洗3次，二抗1∶5000 稀釋，冰上孵育4 h，TPBS溶液洗3次，曝光顯影，實驗重復(fù)3次。

目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常腸黏膜組織和結(jié)腸癌組織中Lgr5的相對表達(dá)量

正常腸黏膜組織與結(jié)腸癌組織中Lgr5表達(dá)量分別為(0.37±0.03)、(0.72±0.04)。與正常腸黏膜組織相比，結(jié)腸癌組織中Lgr5表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-12.124，P<0.001)。見圖1。

注：N代表正常腸黏膜組織，T代表結(jié)腸癌組織，aP <0.05

2.2 篩選CC細(xì)胞株Lgr5相對表達(dá)最高的細(xì)胞株

實時熒光定量PCR檢測顯示，NCM460細(xì)胞、HT-29細(xì)胞、SW620細(xì)胞及LoVo細(xì)胞中Lgr5 mRNA表達(dá)量分別為(1.00±0.01)、(1.04±0.02)、(1.28±0.06)及(1.53±0.04)。與NCM460細(xì)胞相比，Lgr5在LoVo中mRNA表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.643，P<0.001)。Western blot檢測結(jié)果顯示，在上述細(xì)胞系中Lgr5蛋白相對表達(dá)量分別為(0.37±0.02)、(0.41±0.02)、(0.54±0.03)及(0.79±0.05)。與NCM460細(xì)胞相比，Lgr5在LoVo細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.267，P<0.001)。因此，選擇LoVo細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗研究細(xì)胞株。見圖2。

注：aP <0.05；A：RT-PCR法檢測多種CC細(xì)胞株中Lgr5 mRNA相對表達(dá)量；B：Western blot檢測各細(xì)胞株中Lgr5蛋白表達(dá)

2.3 下調(diào)Lgr5表達(dá)對LoVo細(xì)胞侵襲、遷移的影響

對照組、si-NC組及si-Lgr5組細(xì)胞侵襲率分別為(100±0.53)%，(98±2.3)%，(65±1.2)%(圖3A)，根據(jù)各組劃痕寬度計算出對照組、si-NC組及si-Lgr5組細(xì)胞遷移率分別為(100±2.2)%，(96±1.3)%，(55±2.1)%(圖3B)。與對照組及si-NC組比較，si-Lgr5細(xì)胞侵襲率及遷移率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F遷移=18.33，F(xiàn)侵襲=31.75，P< 0.05)。見圖3。

注： aP<0.05；A：Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力；B：劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

2.4 下調(diào)Lgr5表達(dá)對LoVo細(xì)胞血管生成的影響

VEGF在對照組、si-NC組和si-Lgr5組中含量分別為(7.62±0.57)、(7.76±0.62)、(4.16±0.08)pg/mL(圖4A)，bFGF在上述各組中含量分別為(17.02±1.34)、(18.67±1.25)、(12.33±1.27)pg/mL(圖4B)。與對照組和si-NC組比較，si-Lgr5組細(xì)胞中VEGF、bFGF含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FVEGF=9.63，F(xiàn)bFGF=14.85，P<0.05)。見圖4。

注：aP <0.05

2.5 下調(diào)Lgr5表達(dá)抑制LoVo細(xì)胞侵襲遷移機(jī)制的研究

與對照組和si-NC組相比，si-Lgr5組細(xì)胞中Vimentin、N-cadherin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖5、表2。

圖5 各組細(xì)胞Lgr5、Vimentin、N-cadherin及E-cadherin蛋白電泳圖

表2 各組細(xì)胞Lgr5、Vimentin、N-cadherin及E-cadherin表達(dá)變化

3 討論

EMT是形態(tài)發(fā)生的基本過程，由此上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)表型。研究表明，EMT在腫瘤進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用。在惡性腫瘤中，EMT通過許多致癌信號通路、缺氧和腫瘤微環(huán)境信號來啟動和促進(jìn)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附力，獲得遷移和侵襲特性。癌細(xì)胞通過EMT對化學(xué)療法產(chǎn)生抗性并獲得抑制免疫反應(yīng)的能力，在許多類型的癌癥中，已經(jīng)觀察到EMT激活后癌癥干細(xì)胞的出現(xiàn)[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5增強(qiáng)下游Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，Lgr5的CC細(xì)胞表現(xiàn)出高集落形成、自我更新快、異常增殖的特性，同時，具有以下特征：間充質(zhì)相關(guān)基因(例如Snail、Slug、Zeb1、Zeb 2和N-cadherin)的表達(dá)較高，而上皮相關(guān)基因(例如E-cadherin)的表達(dá)較低，總之，由于Lgr5表達(dá)的上調(diào)，能夠促進(jìn)CC細(xì)胞發(fā)生EMT，從而導(dǎo)致CC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[9]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常腸黏膜組織相比，Lgr5在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，LoVo細(xì)胞中Lgr5表達(dá)量較NCM460細(xì)胞和其他CC細(xì)胞株(HT-29、LoVo、SW620)高，因而選擇LoVo細(xì)胞作為后續(xù)實驗研究對象。

腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是臨床治療最大的難題，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往預(yù)示著預(yù)后不良[10-11]。本文通過下調(diào)LoVo細(xì)胞Lgr5表達(dá)，并檢測細(xì)胞侵襲、遷移的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-Lgr5組細(xì)胞侵襲遷移率小于對照組和si-NC組，結(jié)合對結(jié)腸癌組織中Lgr5檢測結(jié)果，說明Lgr5呈高表達(dá)，可能是導(dǎo)致結(jié)腸癌易轉(zhuǎn)移、浸潤的原因之一，而降低結(jié)腸癌細(xì)胞中Lgr5表達(dá)，可能直接抑制LoVo細(xì)胞的腫瘤生物行為學(xué)能力，有可能成為未來治療或輔助治療結(jié)腸癌的治療靶點。

血管新生、新血管的募集是腫瘤血管生成的重要組成部分和轉(zhuǎn)移途徑。血管生成通過提供比正常成熟血管少的基膜和更少的細(xì)胞間連接復(fù)合物，增加了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)的速度[12]。研究表明，EMT導(dǎo)致的侵襲可能會調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的干性并促進(jìn)腫瘤血管生成[13-14]。反之，越來越多的證據(jù)表明，抑制腫瘤細(xì)胞EMT，對腫瘤細(xì)胞的干性和血管生成可造成負(fù)面影響，從而達(dá)到控制腫瘤疾病進(jìn)程的目的[15-16]。VEGF是促血管及促淋巴管新生的細(xì)胞因子，在腫瘤中高表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞快速增殖的重要因素[17]。bFGF屬多受體細(xì)胞因子，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移，降低血管阻力，增加腫瘤組織血供[18]。Vimentin、N-cadherin及E-Cadherin均為腫瘤細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白[19]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組和si-NC組比較，si-Lgr5組Vimentin、N-cadherin、VEGF和bFGF表達(dá)降低，E-Cadherin表達(dá)升高，說明下調(diào)Lgr5在LoVo細(xì)胞中的表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞EMT，能增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附能力，降低細(xì)胞的運(yùn)動能力，同時減少血管生成，減少其通過自生血管獲得更多的“養(yǎng)分”，抑制腫瘤細(xì)胞過快增殖，使腫瘤細(xì)胞難以轉(zhuǎn)移，這與Transwell小室和細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果相一致。

綜上所述，抑制CC細(xì)胞中Lgr5表達(dá)，能夠抑制LoVo細(xì)胞侵襲、遷移，其機(jī)制可能與抑制EMT和血管生成有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)將為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的思路。