精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5在甲硫腺苷磷酸化酶缺陷型惡性胸膜間皮瘤中的作用研究

張 奇, 王志強(qiáng), 蔡華榮, 江躍全

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤轉(zhuǎn)移與個體化診治轉(zhuǎn)化研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶, 400030)

惡性胸膜間皮瘤(MPM)是一種預(yù)后極差的高度侵襲性腫瘤，發(fā)病與長期接觸石棉纖維有關(guān)。根據(jù)Asbestos網(wǎng)站顯示[1-2], 美國每年約有3 000例MPM新發(fā)病例。由于從石棉暴露到發(fā)病要經(jīng)歷30～40年的潛伏期，因此未來MPM的發(fā)病很可能呈上升趨勢[3]。目前針對MPM的治療方案較少且總體效果差，探索MPM新的治療方法有著重要的意義。研究[4]表明，甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)缺陷型腫瘤中蓄積的底物甲硫腺苷可使細(xì)胞內(nèi)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)的甲基化功能處于一種易損狀態(tài)，此時一旦采用外源性制劑使PRMT5表達(dá)下調(diào)，MTAP缺陷型腫瘤PRMT5的甲基化功能將會被顯著抑制，最終抑制細(xì)胞生長，產(chǎn)生一種聯(lián)合殺傷效應(yīng)，但這種聯(lián)合殺傷機(jī)制在MPM中能否產(chǎn)生作用尚不明確。本研究采用RNA干擾及奎那克林抑制PRMT5的表達(dá)，探討其對缺陷型MPM的聯(lián)合殺傷效應(yīng)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 MPM細(xì)胞株: MTAP缺陷型MPM細(xì)胞株(H2591、H2452、H2052), MTAP陽性MPM細(xì)胞株(MPP89、H28、REN), 陽性及陰性對照細(xì)胞株亨廷頓蛋白相關(guān)蛋白-1(HAP-1)(MTAP+/+), HAP-1(MTAP-/-), 均由英國萊斯特大學(xué)皇家醫(yī)院Fennell教授提供。

1.1.2 主要儀器與試劑: PRMT5抗體購自Cell Signaling(#79998S, Hitchin, UK), H4R3me2s(#ab5823)和β-tubulin(#ab6046)抗體購自Abcam(Cambridge, UK)。羊抗兔HRP(#6990S)、驢抗鼠HRP(#7076S)二抗購自Cell Signaling(Hitchin, UK); siPRMT5(#abx929849)購自Abbexa(Cambridge, UK)?？强肆?#69-05-6)購自Sigma (Gillingham, UK)。聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、分子量標(biāo)準(zhǔn)Precision Plus和ECL發(fā)光液(#1705060)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。RIPA組織裂解液(#20-188)購自Millipore。

1.2 方法

1.2.1 Western blot: 從小干擾RNA(siRNA)或奎納克林處理的細(xì)胞中提取總蛋白, BCA法蛋白定量。勻漿蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC膜)上。用脫脂奶封閉膜上非特異位結(jié)合點(diǎn)后，依次加入親和純化的MTAP蛋白、PRMT5蛋白及H4R3me2s蛋白或Tubulin蛋白的特異性抗體進(jìn)行孵育，加入偶聯(lián)過氧化物酶的抗兔或抗小鼠IgG孵育。加入過氧化物酶底物ECL檢測二抗信號。

1.2.2 結(jié)晶紫染色法: 將PRMT5 siRNA轉(zhuǎn)染后的MPM細(xì)胞接種于12孔板，或MPM細(xì)胞接種12孔板后加入1.0 μmol/L奎納克林。1周后，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗接種平板，甲醇固定20 min后PBS再次清洗，常溫干燥，結(jié)晶紫染色20 min, 常溫干燥后獲取染色圖像; 加入500 μL 10%醋酸振搖30 min, 提取出細(xì)胞吸收的結(jié)晶紫，取100 μL在酶標(biāo)儀上測定吸光度。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染法: 設(shè)計協(xié)同以PRMT5為靶標(biāo)的siRNA, 以Gene Silencer(GeLantis公司)為轉(zhuǎn)染載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)前，首先要對siRNA轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染時間、siRNA濃度、轉(zhuǎn)染試劑濃度等條件，目標(biāo)是在無顯著細(xì)胞毒性(死細(xì)胞比率<5%)的前提下，基因特異性沉默效率在蛋白質(zhì)水平要達(dá)到85%以上。細(xì)胞毒性評估采用LIVE/DEAD CELL DYE試劑盒(Invitrogen公司)，在熒光顯微鏡下計數(shù)死細(xì)胞比率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后PRMT5及H4R3me2s蛋白的變化

經(jīng)siPRMT5轉(zhuǎn)染72 h后, MPM細(xì)胞PRMT5蛋白表達(dá)受到抑制, MTAP(-)缺陷型MPM細(xì)胞H4R3me2s甲基化水平下降，而MTAP(+)陽性細(xì)胞H4R3me2s甲基化水平無明顯變化。見圖1。

2.2 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞克隆增殖能力的變化

經(jīng)siPRMT5轉(zhuǎn)染能明顯抑制MTAP(-)缺陷細(xì)胞HAP-1(MTAP-/-)、H2591、H2452、H2052的克隆增殖能力，對MTAP(+)陽性細(xì)胞HAP-1(MTAP+/+)、MPP89、H28、REN無抑制作用或抑制作用微弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023), 提示存在聯(lián)合殺傷作用。見圖2。

2.3 奎那克林處理H2591、H2052、MPP89細(xì)胞株后PRMT5、H4R3me2s蛋白的變化及對細(xì)胞增殖能力的影響

奎納克林(1 μmol/L)可通過抑制MTAP(-)缺陷型惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞(H2591、H2052)PRMT5的表達(dá)，降低H4R3me2s的甲基化水平，產(chǎn)生聯(lián)合殺傷作用，而對MTAP(+)陽性細(xì)胞MPP89無聯(lián)合殺傷作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。見圖3。

3 討 論

PRMT5屬于Ⅱ型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能將蛋白質(zhì)精氨酸殘基進(jìn)行對稱二甲基化[5-7]。研究[8-11]表明，絕大多數(shù)腫瘤的PRMT5呈現(xiàn)過表達(dá)或突變，與預(yù)后不佳有關(guān)。部分惡性腫瘤MTAP基因有不同程度的缺失以及啟動子區(qū)域的甲基化[12-15], 引起MTAP表達(dá)缺失或減弱，導(dǎo)致MTAP的底物MTA在細(xì)胞內(nèi)蓄積，后者增加了腫瘤細(xì)胞對PRMT5進(jìn)一步損耗的敏感性，一旦采用外源性制劑使PRMT5表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)或功能進(jìn)一步被抑制, MTAP缺陷型腫瘤PRMT5的甲基化功能將會受到顯著減弱，最終使細(xì)胞生長受到抑制，產(chǎn)生一種聯(lián)合殺傷效應(yīng)[16-18]。前期研究[19-22]表明,MPM人群中MTAP缺失率達(dá)68%, 這為抑制PRMT5聯(lián)合殺傷并選擇性治療MTAP缺陷MPM提供了分子基礎(chǔ)。

這種MTAP缺陷型腫瘤對PRMT5的依賴性及聯(lián)合殺傷作用在一部分腫瘤中得到了證實(shí)。MAVRAKIS K J[23]曾對2種MTAP陰性胰腺癌細(xì)胞系MIAPaCa2和SU86.86進(jìn)行研究，采用shRNA降低PRMT5的表達(dá)水平，能減少H4R3me2s的甲基化，并有效抑制腫瘤細(xì)胞生長; 而對于表達(dá)MTAP蛋白的HARA移植瘤模型，腫瘤細(xì)胞生長并未受到明顯影響。KRYUKOV G V[24]將MTAP基因引入MTAP陰性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(LU99和H647)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(SF-172)以及胰腺癌細(xì)胞系(SU86.86), 能降低細(xì)胞對PRMT5損耗的敏感性，細(xì)胞生存能力更強(qiáng)。本研究運(yùn)用siPRMT5能顯著降低MPM細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MTAP缺陷型MPM中甲基化H4R3me2s水平更低，細(xì)胞增殖受到了明顯影響。MTAP陽性細(xì)胞中H4R3me2s的變化并不明顯，細(xì)胞生長未受到明顯抑制，表明MTAP缺陷型MPM增加了細(xì)胞對PRMT5損耗的敏感性[25], 一旦基因沉默PRMT5則對MTAP缺陷型MPM產(chǎn)生了顯著的聯(lián)合殺傷效應(yīng)。這種作用是通過進(jìn)一步削弱MTAP缺陷型MPM細(xì)胞PRMT5的甲基化功能，減弱組蛋白H4R3me2s[26-27]的甲基化，后者可能進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯[28], 最終影響細(xì)胞增殖而實(shí)現(xiàn)的。

目前有關(guān)MPM的聯(lián)合殺傷研究鮮有報道，而MPM具有發(fā)病率低、高侵襲性、治療有效率低等特點(diǎn)。BARBARINO M[29]對58例MPM臨床樣本進(jìn)行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)PRMT5處于高表達(dá)水平，該研究對MPM組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，采用shPRMT5下調(diào)MTAP缺陷型MPM原代細(xì)胞及成熟細(xì)胞株的PRMT5水平，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期E2F通路被有效抑制，從而抑制了MTAP缺陷型MPM細(xì)胞的增殖，但該研究并未找到理想的臨床藥物。目前有關(guān)PRMT5抑制劑受到廣泛關(guān)注[30]。EPZ015666是一種PRMT5抑制劑，研究[22]顯示該藥物對MTAP缺陷MPM具有一定的聯(lián)合殺傷作用，但效果也并不理想?？{克林是一種9-氨吖啶類藥物，臨床上曾用于控制惡性胸腔積液[31], 奎納克林還能通過多種分子機(jī)制參與抗腫瘤效應(yīng)[32-37], 例如誘導(dǎo)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)奎那克林對PRMT5具有顯著的轉(zhuǎn)錄抑制作用，奎那克林可在1 μmol/L濃度下對MTAP缺陷型MPM產(chǎn)生明顯的聯(lián)合殺傷效應(yīng)，并且這種殺傷作用僅在H2591及H2052細(xì)胞株明顯，推測奎納克林可能不是直接抑制PRMT5基因啟動子，而可能是通過抑制PRMT5的轉(zhuǎn)錄因子而實(shí)現(xiàn)的，這種轉(zhuǎn)錄因子也許僅存在于H2591及H2052細(xì)胞，而在其他MPM細(xì)胞中缺失，因此出現(xiàn)了細(xì)胞選擇性。

綜上所述，本研究證實(shí)基因沉默PRMT5能對MTAP缺陷型MPM產(chǎn)生明顯的聯(lián)合殺傷作用，奎納克林能有效抑制部分MPM中PRMT5的表達(dá)，聯(lián)合殺傷MTAP缺陷型MPM。