乳腺癌中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8的表達(dá)對預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤的影響

魏 昕, 劉 霞, 2 , 施 琳, 2, 云 芬, 2, 賈永峰, 2

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010000)(2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010000)

乳腺癌侵襲性強、轉(zhuǎn)移率較高、預(yù)后較差, 一般方法難以治療。常用的治療方法包括手術(shù)、化療、放射治療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療等，所以尋找抗腫瘤藥物的靶點和生物標(biāo)志物仍然至關(guān)重要[1]。α1, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(FUT8)基因編碼, FUT8可以將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到N-糖鏈上天冬酰胺連接的N-乙酰氨基葡萄糖殘基的第6位，參與糖蛋白中N-連接的低聚糖的生物合成[2]。FUT8也與疾病密切相關(guān), FUT8與乳腺癌的不良預(yù)后密切關(guān)聯(lián)，具體原因仍有待探究[3]。

1 材料與方法

1.1 TIMER平臺和Oncomine平臺分析FUT8在各類腫瘤中的表達(dá)情況

腫瘤免疫分析數(shù)據(jù)庫(TIMER, https://cistrome.shinyapps.io/timer; TIMER2.0, http://timer.comp-genomics.org)和Oncomine(https://www.oncomine.org)都是基于癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘平臺[4], 這些分析工具通過全基因組表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)有研究和臨床價值的癌基因和抑癌基因，通過2個數(shù)據(jù)庫互相驗證FUT8在各類腫瘤的表達(dá)情況。在TIMER平臺中將組間P<0.01定義為表達(dá)有差異。在Oncomine平臺中，將基因等級(GENE RANK)的閾值設(shè)定為10%, 數(shù)據(jù)類型(DATA TYPE)設(shè)定為全部; 將組間的倍數(shù)變化(FOLD CHANGE)大于1.5、P<0.01定義為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 Kaplan-Meier Plotter平臺分析生存情況

Kaplan-Meier Plotter(http: //kmplot. com/analysis/)是基于GEO、TCGA等的基因芯片和轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)構(gòu)建的平臺，是一種經(jīng)典Kaplan-Meier法生存分析工具。在Kaplan-Meier Plotter中通過對各類臨床特征的分組，并采用95%的置信區(qū)間(95%CI)和自動選取截斷值的設(shè)置來計算出不同臨床特征下的風(fēng)險比(HR)和log-rankP值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 TIMER平臺分析免疫細(xì)胞浸潤情況

依托TIMER的Gene模塊分析FUT8與乳腺癌各個分型中B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞浸潤的關(guān)系，并根據(jù)Cor值評價其相關(guān)性; 依托TIMER2.0平臺的Immune Gene模塊分析FUT8與Treg細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤的關(guān)系，并根據(jù)Rho值來評價相關(guān)性。Cor或Rho值的絕對值>0且P<0.05被視為有相關(guān)性且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 FUT8與其他因子的相關(guān)性分析

利用TIMER2.0和bc-GenExMiner(http://bcgenex.ico.unicancer.fr/)平臺互相驗證FUT8與各個免疫檢查點以及免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性。bc-GenExMiner是基于乳腺癌TCGA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)工具，可以進(jìn)行生存分析、相關(guān)性分析等操作[5]。在TIMER中的Gene_Corr模塊以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性的分析，根據(jù)Rho值的大小評價相關(guān)性; 在bc-GenExMiner中的Gene correlation targeted analysis模塊，以內(nèi)在亞型為分組依據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，并根據(jù)Pearson′s correlation coefficient(cor. )的值來評價相關(guān)性。

1.5 免疫組織化學(xué)驗證

取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 2018—2020 年就診的經(jīng)病理確診的乳腺癌和腺病(良性對照)石蠟切片共40例進(jìn)行FUT8的免疫組織化學(xué)染色，F(xiàn)UT8兔單克隆抗體購于英國Abcam公司(貨號ab191571, 工作濃度1∶500); EDTA修復(fù)液(貨號MVS-0099)、動物非免疫血清(貨號SP KIT-B3)、即用型免疫組化試劑盒(貨號KIT-9921)、DAB顯色試劑盒(貨號DAB-0031)均購于福建邁新公司。實驗步驟按照各試劑說明書操作，并以扁桃體組織染色作為陽性對照, PBS替代一抗作為陰性對照。癌細(xì)胞和乳腺細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色染色且染色細(xì)胞數(shù)>10%被判定為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 FUT8在乳腺癌以及其他癌癥中的表達(dá)情況

FUT8的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, FUT8大多數(shù)定位于胞質(zhì), FUT8在20例乳腺癌組織中17例為陽性，表達(dá)率為85%, 在20例腺病組織中均為陽性，表達(dá)率為100%, 見圖1。

TIMER平臺和Oncomine平臺顯示，與正常組織相比，F(xiàn)UT8在乳腺癌以及多種類型癌組織在轉(zhuǎn)錄組水平上均有上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 說明FUT8可能在乳腺癌中發(fā)揮一定的作用，有望成為乳腺癌的標(biāo)志物之一，見圖2。

另外，在Oncomine平臺以“Breast Cancer”和“Triple Negative Status”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，探討三陰乳腺癌和非三陰乳腺癌中的FUT8表達(dá)。Farmer數(shù)據(jù)庫中FUT8表達(dá)的分組依據(jù)Basal樣和Luminal樣乳腺癌, TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)的分組依據(jù)為是否為ERBB2/ER/PR陰性狀態(tài)。FUT8的表達(dá)在三陰和非三陰乳腺癌間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖3。

2.2 FUT8對于生存預(yù)后的影響

在乳腺癌的研究中，通常將總生存時間(OS)和無復(fù)發(fā)生存時間(RFS)作為評價治療效果的指標(biāo)。本研究在Kaplan-Meier Plotter平臺中發(fā)現(xiàn), FUT8水平的變化與乳腺癌的預(yù)后效果存在相關(guān)性，乳腺癌患者中, FUT8呈低表達(dá)的患者OS和RFS較差，說明乳腺癌患者中FUT8的低表達(dá)可能對患者的生存以及腫瘤轉(zhuǎn)移有不利影響，見圖4。

A、B: 乳腺癌組織中FUT8的免疫組織化學(xué)染色; C、D: 腺病組織中FUT8的免疫組織化學(xué)染色。

A: Farmer數(shù)據(jù)庫中FUT8的表達(dá); B: TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)。

A: 總生存時間圖(n=1879); B: 無復(fù)發(fā)生存時間圖(n=4929)。

同時，本研究對乳腺癌的各類臨床特征進(jìn)行分組并進(jìn)行OS和RFS的分析，分別統(tǒng)計分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53突變情況、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)以及乳腺癌內(nèi)在亞型中不同條件下FUT8水平的變化對于生存和預(yù)后的影響。結(jié)果顯示, FUT8的高表達(dá)會根據(jù)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53狀態(tài)、ER水平、HER2水平改善乳腺癌患者的生存和預(yù)后(HR<1)。同時, TP53突變型和PR陽性患者中, FUT8的高表達(dá)是患者生存和預(yù)后的危險因素(HR>1)。在luminal A亞型以及HER2亞型的患者中, FUT8水平對于預(yù)測預(yù)后具有較高的價值，見表1。

表1 FUT8在乳腺癌不同臨床特征中的生存預(yù)后情況

2.3 FUT8與乳腺癌的免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)性

采用TIMER和TIMER2.0平臺的免疫細(xì)胞浸潤分析模塊，在乳腺癌的3個內(nèi)在亞型(basal亞型、HER2+亞型和 luminal亞型)分別探討了FUT8表達(dá)與各類免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞、Treg細(xì)胞、NK細(xì)胞)浸潤水平的關(guān)系，見圖5。在basal亞型中, FUT8 的水平與CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān); 在HER2+亞型中, FUT8的水平與CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān); 在luminal亞型中，除Treg細(xì)胞外, FUT8表達(dá)水平與各類免疫細(xì)胞浸潤無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

由于巨噬細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展過程中的特殊作用，本研究額外在TIMER2.0平臺上分析了不同亞型乳腺癌中FUT8與各個分型巨噬細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性，見圖6。在basal、HER2、luminal A 3個亞型中, FUT8的表達(dá)水平與M2型巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)。

2.4 FUT8與免疫檢查點以及免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性

本研究通過TIMER2.0和bc-GenExMiner平臺分析了FUT8與一些常見的免疫檢查點以及免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、Treg細(xì)胞、DC細(xì)胞、MDSC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)相關(guān)標(biāo)志物之間的相關(guān)性，見圖7。在乳腺癌basal亞型和HER2亞型中, FUT8的表達(dá)與大多數(shù)標(biāo)志物的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05), 在luminal亞型中呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)或無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見腫瘤，發(fā)病率高，治療棘手，且預(yù)后不理想。手術(shù)、化療、放射治療、內(nèi)分泌治療等均為乳腺癌的主要治療方法，但是對于缺少ER、PR和HER2表達(dá)的三陰乳腺癌患者，現(xiàn)有治療方法不能減緩腫瘤進(jìn)展，而且也不利于提高患者生活質(zhì)量。乳腺癌的診斷和治療策略逐漸成為近年來的研究熱點，腫瘤分子標(biāo)志物檢測以及基于標(biāo)志物的免疫療法逐漸興起，對于乳腺癌的診斷和治療至關(guān)重要。

N-連接糖基化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的對新合成蛋白的修飾過程。N-連接的糖基化過程是由寡糖轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中啟動的，在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的新合成的新生蛋白中，寡糖轉(zhuǎn)移酶將多糖醇中的一個14糖核心多糖轉(zhuǎn)移到N-X-T/S基序的天冬酰胺殘基(其中N是天冬酰胺, X是除脯氨酸之外的任何氨基酸, S是絲氨酸，T是蘇氨酸)。然后，在糖基化蛋白被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜前，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中修剪并進(jìn)一步處理核心多糖[6]。一旦糖基化失調(diào)，蛋白質(zhì)就被轉(zhuǎn)運到胞漿，并迅速被降解。例如，在惡性肝病的發(fā)生和發(fā)展過程中, FUT8的活性顯著升高，從而導(dǎo)致某些血清糖蛋白的α-1, 6-巖藻糖含量升高[7]。本研究通過生物信息學(xué)工具發(fā)現(xiàn)，乳腺癌和正常組織中，F(xiàn)UT8的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 表明FUT8具有作為乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的診斷基因的潛力。

研究[3]發(fā)現(xiàn), FUT8可以在TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中上調(diào)，從而增強腫瘤的侵襲和遷移能力。腫瘤的侵襲能力在一定程度上可以預(yù)示患者的預(yù)后情況，而本研究通過生物信息學(xué)工具卻發(fā)現(xiàn), FUT8水平的上調(diào)在大多數(shù)臨床癌癥類型中都有利于患者生存和預(yù)后，只對TP53的突變和PR陽性的患者不利，由于TP53與腫瘤細(xì)胞的增殖有著密切關(guān)系，推測FUT8和TP53的突變存在某種聯(lián)系，有待于實驗進(jìn)一步驗證。

腫瘤細(xì)胞和腫瘤免疫微環(huán)境(TME)之間的雙向交流對正常組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤生長都是至關(guān)重要的，與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和患者預(yù)后密切相關(guān)[8]。免疫細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境的組分之一，其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因素。大量研究[9]表明, TAMs在腫瘤進(jìn)展的多個方面發(fā)揮著重要作用。本研究探討了在乳腺癌中FUT8的水平與免疫細(xì)胞的浸潤關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的浸潤與FUT8表達(dá)水平相關(guān)，同時M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD163的表達(dá)也與FUT8呈正相關(guān)，說明FUT8在乳腺癌中可能參與了由M2型巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的免疫抑制過程。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌Treg細(xì)胞的浸潤也與FUT8的表達(dá)水平相關(guān)。Treg細(xì)胞對不同環(huán)境刺激的反應(yīng)具有復(fù)雜調(diào)節(jié)作用，研究[10-11]表明，不同類型的腫瘤中Treg細(xì)胞的增加對患者總生存率的影響也是不同的，與上文中FUT8對于生存和預(yù)后的影響結(jié)果也有一定的吻合，具體機制有待于進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在basal亞型中，各類免疫檢查點的表達(dá)水平和FUT8呈正相關(guān)，但是TIGIT的配體PVR(又稱CD155)水平與FUT8呈負(fù)相關(guān), PVR在腫瘤組織中過度表達(dá)，與腫瘤的侵襲和遷移有密切聯(lián)系[12]。NK細(xì)胞是先天免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞，其特征是在破壞腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用，其激活受到多種因素調(diào)控[13]。研究[14]表明, PVR和NK細(xì)胞表面的TIGIT結(jié)合后會抑制NK細(xì)胞的功能。basal亞型中 FUT8與NK細(xì)胞浸潤和NK細(xì)胞標(biāo)志物水平的正相關(guān)關(guān)系也驗證了這一點。

本研究通過生物信息學(xué)工具研究了FUT8在乳腺癌以及其他腫瘤中的表達(dá)情況，以及其與乳腺癌免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系和在不同臨床特征下患者的預(yù)后情況，最后利用免疫組織化學(xué)實驗進(jìn)行初步驗證?？梢娙橄侔┲杏蠪UT8的表達(dá); 乳腺癌中FUT8水平的升高和降低可能預(yù)示著更好的預(yù)后以及更長的生存時間，而且與患者不同的臨床狀態(tài)有密切關(guān)系; 與T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤有一定相關(guān)性，說明FUT8可能是一個評價預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤水平的標(biāo)志物。