高密度脂蛋白對缺血性腦卒中急性期患者外周血中免疫細胞分布的影響

張海岳, 關經(jīng)緯, 王 族, 武 霄, 宋海慶, 孟 然

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 北京, 100053)

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中發(fā)病的重要原因[1]。動脈粥樣硬化可造成血管嚴重狹窄，對應腦功能區(qū)域低灌注，還會導致病變血管內(nèi)湍流，易引起粥樣斑塊破裂或血栓形成，從而誘發(fā)缺血性腦卒中[2-3]。缺血性腦卒中發(fā)病早期即可出現(xiàn)一系列的炎癥反應及免疫反應，特別是T細胞在卒中發(fā)生后24 h內(nèi)就被募集至腦損傷區(qū)域，是造成急性期神經(jīng)細胞損傷的主要免疫細胞[4-6]。此外，在缺血性腦卒中的早期階段，單核細胞在外周血中的分布也明顯增多[7]。

動脈粥樣硬化斑塊的形成主要是因膽固醇和膽固醇酯等脂質成分的沉積。高密度脂蛋白(HDL)可促進膽固醇從細胞內(nèi)流出，清除巨噬細胞內(nèi)多余的膽固醇，從而降低動脈粥樣硬化的發(fā)生率[8]。此外, HDL還具有抗炎和抗凋亡作用，在減緩動脈粥樣硬化進展過程中發(fā)揮重要保護作用[9]。本研究分析急性期缺血性腦卒中患者HDL對免疫細胞分布的影響，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年4月—2020年1月就診于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性缺血性腦卒中患者42例為研究對象。納入標準: ① 年齡18～80歲者; ② 發(fā)病至醫(yī)院就診時間≤7 d者; ③ 磁共振彌散序列成像(MRI-DWI)確認為新發(fā)缺血性腦卒中者; ④ 患者發(fā)病時間已超過取栓和溶栓時間窗，需轉入病房接受標準內(nèi)科治療(治療方式參照中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級預防指南)。本研究通過了首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會的審查和批準，并在納入研究前獲得了患者的知情同意。排除標準: ① 使用任何免疫抑制劑的患者; ② 患有免疫性疾病的患者; ③ 合并嚴重心臟、肝臟及脾臟疾病患者。所有患者均在入院后次日清晨空腹采集血標本，并將所有血樣本進行生化檢測，明確外周血HDL的表達水平，并進一步行流式細胞分析。

1.2 流式細胞儀檢測

所有患者在接受治療前通過肘部采集外周血標本，采用EDTA抗凝采血管收集2 mL新鮮靜脈血，輕輕搖勻，充分抗凝后及時送檢，行流式細胞儀檢測(BD LSRII, Becton Dickinson公司，美國)。

流式細胞儀檢測方法: ① 從每管獲取的血樣本中取100 μL抗凝全血放入流式管，按熒光抗體染色組合加入各自最佳使用量抗體。② 將血液與熒光標記抗體均勻混合后室溫避光反應20 min。③ 向每個樣品管中加入2 mL紅細胞裂解液(1x), 均勻混合后室溫避光孵育10 min。④ 將流式樣品管置于臺式離心機中, 300轉離心5 min, 棄上清。⑤ 向每個樣品管中加入2 mL 流式細胞洗液，混勻后放入臺式離心機中300轉離心5 min, 棄上清。⑥向每個樣品管中加入0.5 mL流式細胞洗液，混勻后4 ℃避光，及時采用流式細胞儀檢測分析。⑦ 采用美國BD LSR II型流式細胞儀分析細胞群，并采用FACS Diva 6.1.3軟件分析細胞群數(shù)據(jù)。檢測的細胞群有: CD3+T細胞, CD3+CD4+T細胞, CD3+CD8+T細胞，單核細胞, CD14+CD16-單核細胞, CD14+CD16+單核細胞。本研究所使用抗體均購自BD Pharmingen (圣何塞，加利福尼亞州，美國)或BioLegend(圣地亞哥，加利福尼亞州，美國)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

本研究共納入42例符合標準的患者，根據(jù)外周血HDL水平的不同分為HDL<1.0 mmol/L組(n=22)和HDL≥1.0 mmol/L組(n=20)。

2.1 HDL對T淋巴細胞分布的影響

本研究分析了腦卒中患者HDL的基礎水平對急性期外周血中T淋巴細胞分布水平的影響，結果發(fā)現(xiàn), HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.032)。進一步分析發(fā)現(xiàn), HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+CD4+T淋巴細胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1), 但CD3+CD8+T淋巴細胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。見圖1。

2.2 HDL對單核細胞分布的影響

本研究通過流式細胞儀分析了入組患者外周血中單核細胞的百分比，并分析了單核細胞的2種主要亞型CD14+CD16-單核細胞和CD14+CD16+單核細胞的百分比。結果顯示，在腦卒中急性期, HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細胞、CD14+CD16-單核細胞和CD14+CD16+單核細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 傾向評分匹配后2組結果比較

鑒于真實世界中女性人群平均HDL水平高于男性人群[10], 本研究中HDL≥1.0 mmol/L組中女性患者的比率也高于男性。為了減少性別對于研究結果的影響，應用SPSS 25.0軟件，以性別、陳舊性腦梗死病史、糖尿病作為協(xié)變量，匹配容差為0.05, 對2組進行1∶1傾向性得分匹配分析，匹配后2組共有13對病例完成匹配，見表1。對于匹配后的13對患者進行統(tǒng)計分析，結果發(fā)現(xiàn)HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組(P=0.039), CD3+CD4+T淋巴細胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組(P<0.0001), CD3+CD8+T淋巴細胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組(P=0.007), 差異均有統(tǒng)計學意義，見圖3。HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細胞、CD14+CD16-單核細胞和CD14+CD16+單核細胞的百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 匹配前后患者臨床資料比較

3 討 論

大量研究[9, 11]表明, HDL水平與動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的風險呈負相關。HDL是膽固醇從細胞或外周組織中轉運至肝臟內(nèi)代謝的主要載體，較高水平的HDL可減少膽固醇在動脈壁內(nèi)聚集，在動脈粥樣硬化病變進程中發(fā)揮保護作用。目前研究[12-13]發(fā)現(xiàn)HDL還具有一定的抗氧化、抗組織增生、抗血栓等作用, HDL還可能在炎癥調節(jié)中發(fā)揮額外的作用，包括抑制單核細胞活化和調節(jié)免疫系統(tǒng)，這些功能均有利于血管的抗動脈粥樣硬化作用。

缺血性腦卒中是目前導致人類高死亡和高致殘風險的主要疾病之一，也是神經(jīng)科學中病因機制研究的重點[14-15]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者發(fā)病早期即可出現(xiàn)明顯的炎癥反應和免疫反應。T細胞作為一類主要的免疫細胞，在缺血性腦卒中后的免疫反應中具有重要的調節(jié)作用。BRAITV H等[16]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中發(fā)病24 h后，在腦缺血區(qū)域及周圍梗死區(qū)域即可檢測到CD3+T淋巴細胞。動物實驗研究[17]發(fā)現(xiàn)，在腦卒中發(fā)病后24～72 h, 在腦缺血區(qū)域可檢測到CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的招募和入侵，并且CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞在缺血性腦卒中患者發(fā)生炎癥反應、腦組織損傷等過程中均發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細胞及CD3+CD4+T淋巴細胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組患者，但CD3+CD8+T淋巴細胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組，表明HDL可減輕腦卒中患者急性期T淋巴細胞的入侵，并且主要通過減少CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞的招募和入侵發(fā)揮腦保護作用，但是并不能抑制腦卒中后對CD3+CD8+T細胞的募集。

單核細胞可在急性腦卒中發(fā)生后4 h入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在發(fā)病后7 d達到高峰[18]。單核細胞根據(jù)分化階段不同而分為多種亞型，其中人類最常見的亞型為CD14+CD16-單核細胞、CD14+CD16+單核細胞、CD16+CD14-單核細胞，這些不同亞型的單核細胞在腦卒中發(fā)生的不同階段發(fā)揮著不同的促炎和抗炎作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中急性期，HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細胞、CD14+CD16-單核細胞和CD14+CD16+單核細胞的百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 表明HDL對于單核細胞的調控作用較小。

既往研究[10, 15]發(fā)現(xiàn)中國女性HDL表達水平高于男性，并且在女性絕經(jīng)期后HDL水平無明顯降低。此外，在真實世界研究[19]中，中國女性人群糖尿病發(fā)病率低于男性。本研究也發(fā)現(xiàn)HDL≥1.0 mmol/L組中女性比率較高，糖尿病比率較低，符合目前中國人群流行病學規(guī)律。為了去除性別和糖尿病對于研究結果的影響，本研究通過傾向性評分匹配分析的方法來去除這些混雜因素的影響，然后檢測2組間免疫細胞分布的差異。結果顯示, HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組患者, CD3+CD8+T淋巴細胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組患者，差異均有統(tǒng)計學意義。HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細胞、CD14+CD16-單核細胞和CD14+CD16+單核細胞的百分比差異無統(tǒng)計學意義。上述研究結果進一步驗證了在缺血性腦卒中急性期患者中，較高水平的HDL常伴隨有低水平的CD3+T淋巴細胞募集，并主要減少CD3+CD4+T淋巴細胞的募集。雖然HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中CD3+CD8+T淋巴細胞百分比高于HDL<1.0 mmol/L組患者，但是總CD3+T淋巴細胞百分比在HDL≥1.0 mmol/L組患者中偏低。由于CD3+CD4+T淋巴細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞是CD3+T細胞發(fā)揮作用的2種主要亞型，因此HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血CD3+CD8+T淋巴細胞百分比的增加可能是因CD3+CD4+T淋巴細胞的減少引起的反饋性增加，但仍需進一步研究證實。

綜上所述，在缺血性腦卒中急性期患者中，較高水平的HDL常伴有低水平的CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞的募集，這種結果可能有利于減少缺血性卒中后的腦組織損傷。