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    丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定通過AMPK/ULK1自噬通路減少腎缺血再灌注損傷作用的研究Δ

    2021-10-26 08:01:42張柏銀唐吉偉
    關鍵詞:丹參酮腎小管咪定

    湯 霆,顧 暉,張柏銀,唐吉偉

    (湖南省腦科醫(yī)院麻醉手術科,湖南 長沙 410011)

    腎缺血再灌注損傷可以導致原發(fā)性移植腎功能障礙,并且是腎移植早期失敗的主要原因[1]。因此,進一步深入研究腎缺血再灌注損傷的機制,對于臨床上腎移植損傷的防治和相關理論研究有著重要意義。研究結果發(fā)現(xiàn),細胞自噬在改善腎缺血再灌注損傷的病理過程中極為重要[2]。傳統(tǒng)中藥丹參具有活血化瘀的功效,其主要有效成分為丹參酮ⅡA,丹參酮ⅡA被廣泛應用于臨床,對腎缺血再灌注損傷有一定的保護作用[3]。右美托咪定為腎移植過程中常用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥,研究結果顯示,其在缺血再灌注損傷中具有一定的器官保護作用[4-6]。但丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定的抗腎缺血再灌注效應是否增強尚不清楚。本研究旨在探討丹參酮聯(lián)合右美托咪定通過單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/Unc-51樣自噬激活激酶1(ULK1)通路介導的自噬減輕腎缺血再灌注損傷的作用,現(xiàn)報告如下。

    1 材料

    1.1 儀器

    DT2000型計算機圖像采集分析系統(tǒng)(日本尼康公司);MS-TS型電子天平(中國上海第二天平儀器廠);3 cm無創(chuàng)動脈夾(上海醫(yī)療器械有限公司);H500型電子顯微鏡(日本日立公司);SD1型全自動生化測定儀(瑞士羅氏公司)。

    1.2 藥品與試劑

    丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司,規(guī)格為每支2 ml∶10 mg,批準文號為國藥準字H31022558);鹽酸右美托咪定注射液[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,規(guī)格為每支2 ml∶200 μg(按右美托咪定計),批號為191011BP,批準文號為國藥準字H20090248];2%戊巴比妥鈉(0.015 ml/kg,湖南中醫(yī)藥大學實驗室配制);抗β-actin兔多克隆抗體[圣克魯斯生物技術(上海)有限公司];白細胞介素(IL)10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司);AMPK一抗[圣克魯斯生物技術(上海)有限公司];ULK1一抗[圣克魯斯生物技術(上海)有限公司];腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司);IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)。

    2 方法

    2.1 動物模型及分組

    SPF級健康Wistar大鼠50只,體重200~250 g(湖南中醫(yī)藥大學動物中心提供),隨機均分為五組:A組(丹參酮ⅡA+右美托咪定)、B組(右美托咪定)、C組(丹參酮ⅡA)、D組(缺血再灌注模型)和E組(假手術組)。五組大鼠稱重后,采用苯巴比妥鈉65 mg/kg腹腔注射麻醉后制備大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型。A、B、C和D組大鼠用無損傷血管夾阻斷雙側腎蒂45 min,如果腎臟顏色先由鮮紅色變蒼白,再轉為暗紅色,則表明腎血管夾閉成功,同時用超聲探頭監(jiān)測腎動脈血流情況。A、B和C組大鼠分別在缺血前30 min經(jīng)腹腔注射丹參酮ⅡA注射液+右美托咪定25 μg/kg、右美托咪定25 μg/kg和丹參酮ⅡA注射液。D、E組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液。再灌注24 h后,取五組大鼠的腎組織和血標本。本研究方案已得到湖南省腦科醫(yī)院倫理委員會批準。

    2.2 觀察指標

    2.2.1 病理切片觀察:經(jīng)過脫水,石蠟包埋處理后,將腎組織切片3~4 μm,蘇木精-伊紅染色,光學顯微鏡下400倍觀察,得出病理學結果。

    2.2.2 細胞凋亡檢測:細胞凋亡用TUNEL法檢測。將3 μm厚度的腎組織石蠟切片進行脫蠟后,分別用核苷酸、TDT酶混合液、辣根過氧化物酶和蛋白酶K標二抗孵育,DAB顯色。陰性對照組是沒有TDT酶的基液。細胞核呈棕黃色顆?;蜃睾稚珵門UNEL陽性反應。隨機抽取每張切片的5個高倍視野(400倍),統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù),根據(jù)公式計算凋亡指數(shù)(AI),AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

    2.2.3 AMPK和ULK1蛋白表達的檢測:取腎組織標本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,加入組織裂解液,離心20 min(6 000 r/min,離心半徑10 cm),設定4 ℃、10 000 g,用上清液進行蛋白定量檢測;接著進行SDS-PAGE蛋白電泳,將其轉移至硝酸纖維素膜中;最后使用含5%脫脂乳的TBST溶液在室溫(25 ℃)密封保存1 h,分別加入抗ULK1一抗和抗AMPK過夜,維持4 ℃,TBST洗膜3次各5 min,加入上述二抗室溫孵育1 h,將抗β-actin兔多克隆抗體作為對照,在Smart Chemi ECL下顯影并分析灰度值(ImageJ2X軟件),以目的蛋白條帶與對照(β-actin)蛋白條帶的灰度值比值來反映ULK1和AMPK蛋白的表達水平。

    2.2.4 細胞因子水平測定:將血標本2 ml于室溫下靜置30 min,離心5 min(6 000 r/min,離心半徑10 cm),留血清。參照說明書,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清TNF-α、IL-6和IL-10水平。

    2.3 統(tǒng)計學方法

    3 結果

    3.1 腎組織病理學改變

    A組大鼠腎小管擴張程度和腎小管上皮細胞腫脹程度均不明顯,腎小球改變不明顯;B組大鼠腎小球擴張程度輕,腎小管上皮細胞腫脹程度輕,腎小管擴張程度為中度;C組大鼠腎組織病理學改變與A組類似;D組大鼠腎組織則有明顯病理變化,可見腎組織切片標本部分有凝固性壞死、脫落,光學顯微鏡下可見腎小球部分壞死,腎小管上皮細胞高度腫脹、變性,腎小管明顯擴張,管壁增厚,管腔狹窄;E組大鼠腎組織在光學顯微鏡下可見腎小管排列整齊,間質(zhì)無充血水腫,見圖1。

    A.A組;B.B組;C.C組;D.D組;E.E組A.group A;B.group B;C.group C;D.group D;E.group E圖1 五組大鼠腎組織蘇木精-伊紅染色結果Fig 1 HE staining of renal tissue of rats in five groups

    3.2 細胞凋亡情況

    A、B、C、D和E組大鼠細胞的AI分別為(16.87±3.82)、(18.34±4.28)、(18.61±3.62)、(34.75±6.03)和(2.78±0.51)。E組大鼠細胞凋亡不明顯;D組大鼠可見大量的凋亡細胞和嚴重的組織損傷;A組大鼠的組織損傷較輕,僅見散在的凋亡細胞;B、C組大鼠組織損傷輕微,可見少量的凋亡細胞。與E組比較,A、B、C和D組大鼠細胞的AI明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與D組比較,A、B和C組大鼠細胞的AI明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TUNEL法檢測的五組大鼠細胞凋亡情況見圖2。

    A.A組;B.B組;C.C組;D.D組;E.E組A.group A;B.group B;C.group C;D.group D;E.group E圖2 TUNEL法檢測的五組大鼠細胞凋亡情況Fig 2 Cell apoptosis detected by TUNEL method in five groups

    3.3 AMPK和ULK1蛋白表達

    與D組比較,A組大鼠腎組織中的AMPK及ULK1表達明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且A組大鼠腎組織中的AMPK和ULK1表達較B、C組少(P<0.05);與E組比較,A組大鼠腎組織中的AMPK和ULK1表達較多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫印跡法檢測的五組大鼠腎組織中AMPK、ULK1蛋白表達情況見表1、圖3。

    圖3 免疫印跡法檢測的五組大鼠AMPK、ULK1蛋白表達情況Fig 3 AMPK and ULK1 protein expression detected by Western blot in five groups

    表1 五組大鼠腎組織中AMPK、ULK1蛋白表達比較Tab 1 Comparison of AMPK and ULK1 protein expression in renal tissues of five groups of

    3.4 組織因子水平

    與E組比較,A、B、C和D組大鼠的炎癥指標(IL-10、IL-6和TNF-α)水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與B、C和D組比較,A組大鼠的IL-6、TNF-α水平明顯降低,IL-10水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

    表2 五組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平比較Tab 2 Comparison of serum levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 among five groups of

    4 討論

    傳統(tǒng)中藥丹參通過獨特的辨證治療和多靶點機制發(fā)揮護腎、改善氣滯血瘀的功效?,F(xiàn)代對丹參有較多的藥理學研究。丹參酮是丹參的主要成分,丹參酮ⅡA注射液被廣泛應用于臨床,并且不良反應少。有研究結果認為,術前積極應用丹參酮ⅡA注射液可提高血清超氧化物歧化酶和血清谷胱甘肽過氧化物酶活性,有效改善術后腎缺血再灌注損傷,其機制是減少了缺血再灌注過程中產(chǎn)生的氧自由基從而減輕組織細胞的損傷[7]。缺血再灌注損傷屬于西醫(yī)的概念,在中醫(yī)的范疇中并沒有提及,但從中醫(yī)學角度來看,人的精神活動由五臟精氣化生和充養(yǎng),存儲精氣,若精氣不足,則腎虛,缺血即所謂氣血虧虛,腎精虧損。缺血再灌注后,因腎精氣不足,氣血的運行受阻,血瘀氣滯。丹參具有活血化瘀之功效。五臟藏精氣而不泄,以藏為貴。氣血運行通暢,則氣血滿盈,腎精得藏而復其功用。眾多研究結果表明,丹參在腦、心肌及腎缺血再灌注損傷等方面均有較好的療效[8-13]??梢姷⒃诨钛鐾ńj方面發(fā)揮著重要作用,使臟得藏,腑得通,各得其用。

    自噬是一種維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞完整性的“自我進食”過程。以微管相關蛋白輕鏈3(LC3)Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的變化為特征的自噬功能障礙參與了各種腎損傷[14]。通常通過測定自噬標志性指標來檢測所有活細胞中自噬的動態(tài)過程,除了上述2個指標外,還包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1、AMPK和ULK1復合物[15]。據(jù)文獻報道,活化的AMPK可磷酸化ULK1,ULK1作為調(diào)節(jié)自噬的關鍵分子,可提高FUNDC1與LC3結合的效率[16]。提示AMPK可能通過上游啟始蛋白ULK1的調(diào)節(jié)作用從而發(fā)揮細胞自噬功能。自噬與細胞凋亡有著密切關系。在某些情況下,上調(diào)自噬能抑制細胞調(diào)亡[17];而抑制自噬則能導致細胞調(diào)亡[18]。相關研究結果揭示了自噬與炎癥因子的關系,細胞因子的轉錄、調(diào)控和分泌在某種程度上受自噬的直接影響[19]。以上研究結果表明,自噬作用可能減輕炎癥因子的釋放,從而減輕腎缺血再灌注損傷。

    本研究結果發(fā)現(xiàn),腎缺血再灌注導致自噬關鍵分子AMPK和ULK1表達升高,IL-6、TNF-α表達增強,IL-10表達輕度升高;丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定降低了AMPK和ULK1的表達及其磷酸化,抑制了炎癥因子IL-6、TNF-α的表達,同時大幅增加了抗炎因子IL-10的表達。由此推斷,腎缺血再灌注時,使用丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定對腎功能有保護作用,可能是通過調(diào)控AMPK/ULK1信號通路,進而調(diào)控炎癥相關因子(TNF-α、IL-6和IL-10)的表達水平,減輕組織一系列連鎖炎癥反應,抑制細胞凋亡,從而減少腎組織病理學改變,最終緩解腎功能損害。

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