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    RP-HPLC測定人血漿中伏立康唑濃度及其應(yīng)用分析

    2021-10-26 03:48:46吳水發(fā)林志強(qiáng)洪麗綿張清泉陳喆鳴陳婷婷
    中國醫(yī)藥科學(xué) 2021年17期
    關(guān)鍵詞:伏立康卡馬西平血藥濃度

    吳水發(fā) 林志強(qiáng) 洪麗綿 張清泉 陳喆鳴 陳婷婷

    福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院藥劑科,福建泉州 362000

    伏立康唑(Voriconazole)是第二代三氮唑類抗真菌藥物,抗菌譜廣,對曲霉菌、念珠菌、隱球菌等深部真菌感染療效顯著,常用于侵襲性真菌病的治療與預(yù)防[1-3]。伏立康唑還可用于治療耐氟康唑念珠菌、鐮刀菌屬、足放線菌屬引起的嚴(yán)重感染[4-5]。

    伏立康唑血藥濃度個體差異較大,易受CYP2C19基因多態(tài)性等因素的影響[6-8]。伏立康唑主要經(jīng)CYP2C19代謝,部分經(jīng)CYP2C9和CYP3A4代謝,同時伏立康唑能抑制這3種酶的活性,藥物相互作用較復(fù)雜[9]。使用伏立康唑的患者中約15%出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng),約30%療效欠佳[10]。因此,伏立康唑在臨床應(yīng)用中有必要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)。本研究擬建立一種反相高效液相色譜法,用于測定人血漿中伏立康唑濃度。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    島津高效液相色譜儀(LC-20AT型);HC-2516高速離心機(jī)(安徽中科中佳科技儀器有限公司);25BTS萬分之一電子天平(Satorius公司);WXH微型渦旋混合器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);MGS-2200C氮吹儀(EYELA,日本)。

    1.2 試劑與藥品

    伏立康唑化學(xué)對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號100862-201903);卡馬西平化學(xué)對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號100142-201706);甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司公司,色譜純);乙腈(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,色譜純);水為超純水;其他試劑均為分析純??瞻籽獫{為健康人血漿,由福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院(本院)檢驗(yàn)科提供。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件 色譜柱:Shim-pack Scepter C18-120(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(57:43,V/V);等度洗脫;流速:1.1 ml/min;柱溫:38 ℃;LC停止時間(L):16 min;PDA結(jié)束時間(E):16 min;檢測波長:255 nm;進(jìn)樣量:100 μl。

    1.3.2 溶液及質(zhì)控品配備 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液:精密稱取伏立康唑10.0 mg于10 ml容量瓶中,加甲醇溶解稀釋至刻度。量取該伏立康唑貯備液適量,用甲醇稀釋,制得一系列伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液,質(zhì)量濃度分別為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 和 160.0 μg/ml。

    卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液:稱取卡馬西平10.0 mg于10 ml容量瓶中,加甲醇溶解稀釋至刻度。量取該卡馬西平貯備液適量,用甲醇稀釋,制得一系列卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液,質(zhì)量濃度分別為5、20、80 μg/ml。

    伏立康唑質(zhì)控(QC)血漿樣本:吸取450 μl空白血漿,加入50 μl伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制得伏立康唑高、中、低3個濃度QC血漿樣本,質(zhì)量濃度分別為 8、2、0.5 μg/ml。

    卡馬西平QC血漿樣本:吸取450 μl空白血漿,加入50 μl卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液,制得卡馬西平高、中、低3個濃度QC血漿樣本,質(zhì)量濃度分別為8、2、0.5 μg/ml。

    1.3.3 血漿樣品預(yù)處理 ①加入乙腈600 μl,渦旋振蕩3 min,14 500 r/min離心5 min。②取全部上清,加入乙酸乙酯∶正己烷(4 ∶ 1,V/V)500 μl,渦旋振蕩1 min,15 000 r/min離心5 min。③吸取全部上層有機(jī)相,50℃下氮?dú)獯蹈?。④殘?jiān)?00 μl流動相復(fù)溶,渦旋振蕩3 min。14 500 r/min離心5 min。⑤取250 μl于進(jìn)樣瓶中,進(jìn)樣量100 μl。

    1.4 方法學(xué)考察

    1.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白血漿+卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿+伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液+卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液、患者血漿+卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液,總體積均為 500 μl,按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理,按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。

    1.4.2 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限考察 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別取450 μl空白血漿,加入50 μl伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液,使伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液終濃度分別為 0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 和 16.00 μg/ml,再各加入 50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理,按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。以伏立康唑峰面積(A)與卡馬西平峰面積(AI)比值即A/AI為縱坐標(biāo),以伏立康唑濃度為橫坐標(biāo),采用最小加權(quán)二乘法進(jìn)行線性回歸分析。

    最低定量限:取0.03125 μg/ml的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液,平行檢測5次,以考察靈敏度。

    1.4.3 提取回收率考察 假設(shè)A為伏立康唑/卡馬西平高、中、低3個濃度QC血漿樣本,B為用流動相配置成與A相同濃度的高、中、低3個濃度的伏立康唑/卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本。A、B所取體積均為500 μl,每個濃度取5個樣本。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理,按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算提取回收率。提取回收率=A峰面積/B峰面積。

    1.4.4 準(zhǔn)確度和精密度考察 取伏立康唑高、中、低3個濃度QC血漿樣本各450 μl,再各加入50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理,按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。每個濃度取5個樣本,連續(xù)檢測3 d,計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。

    1.4.5 穩(wěn)定性考察 從3個條件進(jìn)行穩(wěn)定性考察:①室溫穩(wěn)定性:室溫放置24 h;②長期冷凍穩(wěn)定性:于-20 ℃冷凍保存3個月;③反復(fù)凍融穩(wěn)定性:反復(fù)凍融3次。取伏立康唑高、中、低3個濃度QC血漿樣本各450 μl,再各加入50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理,按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。每個條件每個濃度各取5個樣本,計(jì)算實(shí)測值。

    1.4.6 實(shí)用性考察 以臨床實(shí)際檢測樣本為例,考察方法學(xué)的實(shí)用性。取患者血漿500 μl,加入50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理,按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。

    2 結(jié)果

    2.1 專屬性

    伏立康唑和卡馬西平色譜峰完全分離,峰形良好,其中卡馬西平色譜峰保留時間約8.8 min,伏立康唑保留時間約13.1 min。本方法專屬性較好。見圖1。

    圖1 血漿中伏立康唑和卡馬西平的高效液相色譜圖

    2.2 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限

    伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.3791x+0.0039(R2=0.9992,N=10)。伏立康唑在0.03125~16 μg/ml內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。伏立康唑最低定量限為0.03125 μg/ml。0.03125 μg/ml伏立康唑血漿樣本經(jīng)5次檢測,準(zhǔn)確度為(101.54±13.15)%,RSD為12.95%,信噪比S/N>3,符合靈敏度要求。見圖2。

    圖2 伏立康唑在空白血漿樣本中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    2.3 提取回收率

    伏立康唑及卡馬西平提取回收率均>92%,方法可行。見表1。

    表1 提取回收率檢測結(jié)果(,n=5,%)

    表1 提取回收率檢測結(jié)果(,n=5,%)

    濃度(μg/ml) 伏立康唑 卡馬西平8 95.53±9.70 94.14±6.59 2 92.53±6.45 92.13±4.71 0.5 93.33±5.37 93.72±8.33

    2.4 準(zhǔn)確度和精密度

    各梯度濃度日內(nèi)、日間RSD均<10%,該方法準(zhǔn)確度和精密度符合生物樣本分析要求。見表2。

    表2 測定伏立康唑血藥濃度方法學(xué)的精密度和準(zhǔn)確度(,n=5)

    表2 測定伏立康唑血藥濃度方法學(xué)的精密度和準(zhǔn)確度(,n=5)

    QC濃度(μg/ml)(μg/ml)RSD(%)日間濃度(μg/ml)RSD(%)日內(nèi)濃度8 7.91±0.28 3.54 7.81±0.32 4.08 2 2.02±0.18 8.86 1.91±0.17 8.99 0.5 0.51±0.05 9.94 0.49±0.05 9.98

    2.5 穩(wěn)定性

    3種不同穩(wěn)定性條件下,伏立康唑檢測結(jié)果穩(wěn)定性較好,RSD均<15%。見表3。

    表3 不同條件下伏立康唑在血漿中的穩(wěn)定性(,n=5)

    表3 不同條件下伏立康唑在血漿中的穩(wěn)定性(,n=5)

    實(shí)驗(yàn)條件(%) 實(shí)測值 RSD(%)室溫24 h 7.95±0.27 3.431.99±0.2311.460.51±0.0714.69冷凍3個月 7.83±0.182.291.92±0.178.81 0.47±0.0613.39凍融3次 7.78±0.33 4.261.86±0.2412.710.48±0.0611.95 8 μg/ml 2 μg/ml 0.5 μg/ml實(shí)測值 RSD(%) 實(shí)測值 RSD

    2.6 實(shí)用性

    2020年本院共檢測230個伏立康唑樣本,中位數(shù)為2.19(1.14~3.50)μg/ml。其中60.87%在1~5.5 μg/ml,21.74%低于目標(biāo)值,17.39%高于目標(biāo)值。選取其中有代表性意義的18個樣本,制成散點(diǎn)圖,分析本方法學(xué)的實(shí)用性。見圖3。

    圖3 部分臨床樣本TDM結(jié)果

    3 討論

    3.1 預(yù)處理方法的選擇

    有文獻(xiàn)[11]采取3∶1(V/V)甲醇沉淀法處理血漿樣本,該方法可使伏立康唑過度稀釋,導(dǎo)致檢測靈敏度下降。也有文獻(xiàn)[12]采用2∶1(V/V)乙腈沉淀法,再用氮?dú)獯蹈?,少許流動相復(fù)溶,可解決伏立康唑過度稀釋的問題。但研究中發(fā)現(xiàn),氮?dú)獯蹈珊蟮某猎须s質(zhì)太多,部分呈黏稠狀,很難徹底吹干,加入流動相后,溶解不夠充分,且內(nèi)源性物質(zhì)濃度同時被放大,影響檢測結(jié)果。因此,本研究在采取乙腈沉淀蛋白法的基礎(chǔ)上,用萃取液(乙酸乙酯/正己烷,4∶1,V/V)萃取,再用氮吹法將上層有機(jī)相吹干,加少量流動相復(fù)溶。通過乙腈沉淀法及萃取法,血漿樣本中的蛋白沉淀較完全,內(nèi)源性物質(zhì)去除較徹底,對目標(biāo)色譜峰干擾少,在一定程度上可降低柱壓,降低色譜柱堵塞風(fēng)險,起到保護(hù)色譜柱的作用。通過氮?dú)獯蹈煞吧倭苛鲃酉鄰?fù)溶法,可使伏立康唑及卡馬西平高度濃縮,伏立康唑最低定量限可達(dá)0.03125 μg/ml,檢測靈敏度明顯改善[11-12]。另一方面,血樣預(yù)處理后,伏立康唑及卡馬西平提取回收率較高,本方法學(xué)具優(yōu)越性。

    3.2 流動相的選擇

    HPLC法測定伏立康唑血藥濃度多采用磷酸鹽緩沖液[13-16]。在色譜分析系統(tǒng)中,常使用緩沖鹽調(diào)節(jié)流動相pH值。但緩沖鹽的過度使用會縮短色譜柱的使用壽命,特別是當(dāng)緩沖鹽析出時,可造成色譜柱堵塞,引起柱壓升高、柱效下降,使保留時間不穩(wěn)定或色譜峰形發(fā)生改變(裂峰、拖尾等)。緩沖液易滋生細(xì)菌,pH值易發(fā)生改變,常要求現(xiàn)配現(xiàn)用,也增加了工作量。本研究采用甲醇-水作為流動相,配制簡單,可有效保護(hù)色譜系統(tǒng)。甲醇價格低廉且化學(xué)穩(wěn)定性較好,使色譜條件更為穩(wěn)定。研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)甲醇-水比例為57∶43(V/V),柱溫為38 ℃,流速為1.1 ml/min時,可在縮短出峰時間的同時保證良好的分離度,有效提高檢測效率。

    3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

    內(nèi)標(biāo)物應(yīng)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、與目標(biāo)物質(zhì)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、與目標(biāo)物質(zhì)極性差異大等特點(diǎn)。本研究采用卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)物,可符合要求。研究表明,內(nèi)標(biāo)峰與樣品峰分離度大于2。研究中發(fā)現(xiàn),卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液于4 ℃冰箱放置1年仍可保持較好的穩(wěn)定性。

    3.4 本方法用于治療藥物監(jiān)測的意義

    2020年本院共檢測230個伏立康唑樣本,只有60.87%的樣本在目標(biāo)范圍內(nèi),進(jìn)一步說明進(jìn)行伏立康唑TDM的必要性。根據(jù)TDM結(jié)果,進(jìn)行合理的用藥建議,有效提高伏立康唑臨床應(yīng)用的有效性和安全性,進(jìn)一步說明本方法學(xué)的實(shí)用性。

    研究表明[17],當(dāng)伏立康唑未給予負(fù)荷劑量時,要在5~7 d后才能達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度,當(dāng)給予負(fù)荷劑量時,在3~5 d后可達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。有劑量調(diào)整時,應(yīng)于調(diào)整后5 d復(fù)查血藥濃度[18]。國內(nèi)外多部指南均建議伏立康唑應(yīng)給予負(fù)荷劑量,并進(jìn)行TDM,在發(fā)生不良反應(yīng)、治療效果欠佳、序貫給藥、停用或增加可能引起相互作用的藥物時應(yīng)再次進(jìn)行TDM[19-20]。當(dāng)伏立康唑低于1 μg/ml時,容易導(dǎo)致治療失敗;當(dāng)濃度高于5.5 μg/ml不良反應(yīng)發(fā)生率較高,包括肝毒性、視覺障礙、神經(jīng)毒性、皮疹等[21-22]。因此,普遍認(rèn)為1~5.5 mg/L是一個能最大化提高療效,同時能明顯減少不良反應(yīng)的TDM濃度范圍[23]。

    TDM進(jìn)一步證實(shí)正確采血時間的重要性。1號樣本濃度為0.65 μg/ml。經(jīng)分析,該患者在使用伏立康唑第2天就采血,此時因尚未達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度,建議第4天復(fù)查,結(jié)果為2.27 μg/ml(2號樣本)。3號樣本濃度為0.72 μg/ml,采血時間為第3天再次給藥前30 min。經(jīng)分析,該患者未予負(fù)荷劑量,給藥第3天未達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度,建議第5天復(fù)查,結(jié)果為1.66 μg/ml(4號樣本)。5號樣本濃度為0.46 μg/ml,建議增加劑量,劑量調(diào)整后第2天復(fù)查,結(jié)果為0.79 μg/ml(6號樣本)。經(jīng)分析,該患者中途更改劑量,但劑量調(diào)整后第2天尚未達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度,建議劑量調(diào)整后第5天復(fù)查,結(jié)果為 1.95 μg/ml(7 號樣本)。

    TDM可發(fā)現(xiàn)潛在的藥物相互作用。8號樣本濃度為7.89 μg/ml,經(jīng)分析,該患者同時聯(lián)用奧美拉唑,CYP2C19為超快代謝型。奧美拉唑可競爭性抑制CYP2C19代謝酶,使伏立康唑消除減慢[24]。降低劑量后,濃度恢復(fù)到3.32 μg/ml(9號樣本)。10號樣本濃度為0.61 μg/ml,經(jīng)分析,該患者同時聯(lián)用地塞米松。伏立康唑聯(lián)用地塞米松時可使伏立康唑的清除率增加41.0%[25]。停用地塞米松后,濃度恢復(fù)到2.09 μg/ml(11號樣本)。12號樣本濃度為0.09 μg/ml,經(jīng)分析,該患者為肺結(jié)核患者,但在伏立康唑給藥前3 d已停用利福平。利福平為細(xì)胞色素P450酶強(qiáng)誘導(dǎo)劑,停藥后其肝藥酶誘導(dǎo)作用仍可持續(xù)7~10 d,甚至更長[26]。該患者停用利福平12 d后,重啟伏立康唑藥物治療方案,最終測得濃度為1.91 μg/ml(13號樣本)。

    兒童伏立康唑血藥濃度個體差異比成人更明顯,影響因素更復(fù)雜,血藥濃度與劑量相關(guān)性較小,一般需要比成人更大的劑量(按體重算)[27]。14號樣本濃度為0.84 μg/ml,經(jīng)分析,該患者為5歲男孩,體重18 kg,給藥方案為100 mg,q12 h。根據(jù)說明書,伏立康唑用于2~12歲兒童,維持劑量8 mg/kg。最后調(diào)整給藥方案為150 mg,q12 h,血藥濃度升到1.88 μg/ml(15號樣本),抗感染效果明顯改善。通過伏立康唑TDM,可實(shí)現(xiàn)兒童患者的個體化給藥。

    TDM可發(fā)現(xiàn)潛在的藥物不良反應(yīng)。16號樣本濃度為8.98 μg/ml,經(jīng)分析,該患者入院時肝功能正常,用伏立康唑治療后第5天谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶均升高了3倍多,同時伏立康唑谷濃度為8.98 μg/ml。伏立康唑血藥濃度≥4~6 μg/ml時,肝損傷的風(fēng)險可增加4倍[28]。經(jīng)綜合考慮,建議醫(yī)生停用伏立康唑,改用卡泊芬凈,1周后轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常。17號樣本濃度為6.79μg/mL,同時患者出現(xiàn)低鉀血癥、視物模糊。經(jīng)分析,該患者出現(xiàn)低鉀血癥可能與伏立康唑濃度過高有關(guān)[29]。降低伏立康唑劑量后,復(fù)查血藥濃度為2.51 μg/ml(18號樣本),同時該患者電解質(zhì)紊亂得到糾正,視力恢復(fù)正常。

    綜上所述,伏立康唑體內(nèi)藥動學(xué)復(fù)雜,個體差異較大,藥物相互作用較多,有必要進(jìn)行TDM。本方法學(xué)靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,滿足開展TDM的基本要求。在方法學(xué)應(yīng)用中,解決了很多臨床實(shí)際問題,實(shí)現(xiàn)個體化給藥。

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