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    CB1R參與水楊酸鈉誘導(dǎo)大鼠耳鳴研究

    2021-10-26 14:24:56葛佳麗李婷李雅蘭肖倩文左健王采集喬月華
    中華耳科學(xué)雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:水楊酸鈉水楊酸聽力

    葛佳麗 李婷李雅蘭肖倩文左健王采集喬月華*

    1徐州醫(yī)科大學(xué)(江蘇221004)

    2徐州醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心(江蘇221004)

    3江蘇省人工聽覺工程實(shí)驗(yàn)室(江蘇221004)

    4徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇221002)

    耳鳴是指在無外界聲、光刺激的情況下,患者主觀所感知到的一種異常的聲音癥狀。據(jù)不完全估計(jì)我國(guó)耳鳴患者有1.2億,約占總?cè)丝诘?0%,其中進(jìn)行求醫(yī)治療的僅有5%[1]。但迄今為止耳鳴具體發(fā)病機(jī)制仍然尚未明確,臨床診療效果差,患者仍承受著耳鳴的痛苦。因此,深入研究耳鳴發(fā)病機(jī)制是解決這一世界性醫(yī)學(xué)難題的唯一希望。

    現(xiàn)有研究顯示大劑量水楊酸可引起人和動(dòng)物出現(xiàn)聽力下降和耳鳴[2],同時(shí)也是目前國(guó)內(nèi)外耳鳴動(dòng)物模型的構(gòu)建方法,該模型具有快速、高效、方便、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)[3,4]。目前研究認(rèn)為水楊酸鈉破壞聽覺通路中興奮和抑制之間的平衡,改變突觸可塑性,導(dǎo)致耳鳴的發(fā)生發(fā)展[5]。

    CB1R首先在大腦中被發(fā)現(xiàn)且其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及外周神經(jīng)系統(tǒng)中均存在表達(dá)[6]。CB1R通過抑制突觸前終末γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸的釋放以及氮氧化物的產(chǎn)生,具有抗興奮毒性作用、神經(jīng)保護(hù)作用[7],或許在水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴過程中存在重要調(diào)控機(jī)制。

    因此,本研究在水楊酸誘導(dǎo)大鼠耳鳴模型中,以聽覺中樞信號(hào)傳導(dǎo)起始部位——蝸核為重點(diǎn)研究對(duì)象,探索CB1R在不同時(shí)間水楊酸誘導(dǎo)耳鳴模型中的表達(dá)變化,對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行深入討論。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

    本次實(shí)驗(yàn)使用健康、雄性清潔級(jí)SD大鼠60只,體重為250~270克,購(gòu)買自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均飼養(yǎng)于通風(fēng)屏障系統(tǒng)內(nèi),室溫為24℃~26℃,12小時(shí)光照交替,自由飲水進(jìn)食,保持墊料干燥潔凈。本實(shí)驗(yàn)所有流程符合徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理管理?xiàng)l例規(guī)定。

    1.1.2 試劑

    實(shí)驗(yàn)用水楊酸鈉購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司(置于4℃冰箱長(zhǎng)期保存),BCA測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),兔多克隆抗CB1抗體(Abcam公司),鼠單克隆抗β-actin(美國(guó)Proteintech公司),CB1R引物以及內(nèi)參β-actin(上海生工生物工程有限公司),羊抗兔熒光二抗(Abcam公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組

    所有動(dòng)物模型的建立均參照先前研究穩(wěn)定模型[8]。本次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取雄性SD大鼠60只,按隨機(jī)分組法分為NS 7天組、SS 7天組、NS 14天組、SS 14天組,每天分別給予SS組7%SS 200mg/kg,對(duì)照NS組給予相同劑量0.9%NS腹腔注射。連續(xù)給藥,每日兩次,給藥時(shí)間分別為上午8時(shí)以及下午16時(shí)。

    1.2.2 PPI檢測(cè)

    水楊酸鈉誘導(dǎo)大鼠耳鳴樣行為的檢測(cè)均參照既往研究[9]。先隨機(jī)給予大鼠10次115dB SPL的脈沖刺激,緊接著隨機(jī)給予30次聲刺激,包括10次115dB SPL脈沖刺激、10次沒有前聲的驚跳反射刺激和10次前脈沖驚跳反射刺激。驚跳刺激的時(shí)間間隔為27-32s。PPI值計(jì)算公式為(1-PPI/ASR)×100%。隨后再次根據(jù)公式 PPI(%)=1-(ASRPPI)/ASR×100%,計(jì)算前脈沖抑制率。

    1.2.3 ABR檢測(cè)

    ABR測(cè)試用Neurosoft公司聽覺腦干誘發(fā)反應(yīng)儀于隔音屏蔽室中進(jìn)行。4%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉,大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后,將記錄電極置于外耳道口與顱正中線交叉處皮下插入顱骨與硬腦膜之間,參考電極置于兩側(cè)乳突皮下,接地電極置于尾巴根部,給聲音耳機(jī)放置距左側(cè)外耳道口0.5cm。分別給予大鼠不同頻率的聲信號(hào):Click、Tone burst(6k、8k、10k、12k、16k)。從 80dB SPL開始測(cè)試,以10dB SPL逐級(jí)遞減,采用“升5降10法”反復(fù)測(cè)量以確定最低聽閾。

    1.2.4 Q-PCR

    提取蝸核部位總RNA,用所獲取RNA樣本反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增檢測(cè),以βactin作為內(nèi)參基因,對(duì)比分析判斷目的基因CB1R表達(dá)情況。CB1R引物上游:CCTGCTGAACTCCACCGTGAAC,下游為:CTGTGTTGTTGGCGTGCTTGTG;內(nèi)參β-actin引物上游:CCCTGGCTCCTAGCACCAT,下游:TAGAGCCAATCCACACAG。均由上海生工生物工程有限公司合成。CB1R基因表達(dá)變化采用比較閾值法即計(jì)算2-△△CT[10]。

    1.2.5 Western Blot

    取適量組織置于蛋白酶抑制劑和裂解液中勻漿,離心后收集上清,測(cè)定蛋白濃度。電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2h,一抗選用兔多克隆抗CB1R(1:200)和鼠單克隆抗GAPDH(1:5000)孵育過夜,TBST洗滌后,熒光標(biāo)記二抗(1:150)室溫孵育2h,TBST再次洗滌后,應(yīng)用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(美國(guó)Li-COR公司)掃描蛋白條帶。選用GAPDH作為內(nèi)參照,并用Image J軟件對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行半定量分析。

    1.2.6 免疫熒光染色

    實(shí)驗(yàn)前將制備的16um冰凍切片室溫下放置20-30min復(fù)溫;PBS清洗后封閉(5%山羊血清與10%Triton按100:3的比例混合);一抗為兔多克隆抗CB1R(1:200)孵育過夜,二抗為羊抗兔紅色二抗(1:200)孵育1h。DAPI復(fù)染,PBS漂洗后滴加抗熒光淬滅封片膠后蓋上玻片,指甲油封片,正置熒光顯微鏡下觀察拍照,統(tǒng)計(jì)腦片單位面積平均熒光強(qiáng)度。

    2 數(shù)據(jù)分析

    采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩組間均數(shù)差異性比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間均數(shù)差異性比較使用單因素方差分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 水楊酸鈉誘導(dǎo)大鼠耳鳴行為的產(chǎn)生

    與對(duì)照NS7天組相比,SS7天組大鼠PPI2、PPI4以及PPI8均有顯著增加(t=-5.325,P=0.006;t=-8.148,P=0.001;t=-3.301,P=0.03,P<0.05);與NS14天相比,SS14天組大鼠PPI2、PPI4以及PPI8均有顯著增加(t=-13.858,P=0.000;t=-4.872,P=0.008;t=-4.712,P=0.009,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。前脈沖抑制率越大,驚跳反射被抑制的幅度越小。注射水楊酸鹽后大鼠出現(xiàn)耳鳴樣行為,耳鳴填補(bǔ)了背景噪聲的間隔,從而減小了前抑制作用。

    圖1 水楊酸鈉注射后對(duì)于前脈沖抑制率的影響。A、B分別為給予SS7天與SS14天后大鼠前脈沖抑制率變化;前脈沖刺激:PPI2:75dB SPL;PPI4:80dB SPL;PPI8:85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)(n=15)。Fig.1 Effect of sodium salicylate injection on the inhibition rate of prepulse.A and B show the changes of pre pulse inhibition rate of rats after 7 and 14 days of chronic injection of sodium salicylate;pre pulse stimulation:PPI2:75dB SPL;PPI4:80dB SPL;

    PPI8:85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)(n=15).

    3.2 水楊酸鈉引起大鼠短暫性聽力下降

    應(yīng)用ABR檢測(cè)儀對(duì)大鼠聽力閾值檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)(圖2):相比于對(duì)照NS7天組,SS7天組大鼠聽力閾值均有上移(t=-2.0,P=0.116;t=-0.5,P=0.643;t=-1.0,P=0.374;t=-0.378,P=0.725;t=-1.0,P=0.374;t=-1.225,P=0.288,P>0.05),與NS14天組相比,SS14天組大鼠聽閾均有上移(t=-1.414,P=0.23;t=-2.121,P=0.101;t=-2.121,P=0.101;t=-2.0,P=0.116;t=-0.707,P=0.519;t=-1.061,P=0.349,P>0.05),但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。注射水楊酸鈉后,不同時(shí)間組不同頻率下耳鳴大鼠均伴有輕微聽力損失出現(xiàn)。

    圖2 不同時(shí)間慢性注射水楊酸鈉后對(duì)于大鼠聽力影響。A、B分別為給予SS慢性注射7天與14天后大鼠聽力閾值變化;數(shù)值均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=15)。Fig.2 Effects of chronic injection of sodium salicylate at different times on hearing of rats.A and B show the change of hearing threshold of rats after 7 and 14 days of chronic injection of sodium salicylate;the values are expressed by mean±standard deviation(n=15).

    3.3 CB1R在蝸核中mRNA表達(dá)

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析顯示(圖3):SS注射7天后,CB1R在大鼠蝸核中的表達(dá)均有明顯增加(t=2.968,P=0.0412,P<0.05),而在 SS注射 14天后,CB1R在大鼠蝸核中的表達(dá)均有明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.168,P=0.014,P<0.05)。

    圖3 水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴模型中CB1R在蝸核中mRNA表達(dá)變化。A:SS注射7天后耳鳴大鼠蝸核中CB1 mRNA表達(dá)增加(P=0.0412,*P<0.05)(n=5);B:SS注射14天后耳鳴大鼠蝸核中CB1 mRNA表達(dá)減少(P=0.014,*P<0.05)(n=5)。Fig.3 Changes of CB1R mRNA expression in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A:CB1 mRNA expression increased in the cochlear nucleus of tinnitus rats after 7 days of sodium salicylate injection(P=0.0412,*P<0.05)(n=5);B:CB1 mRNA expression decreased in the cochlear nucleus of tinnitus rats after14 days of sodium salicylate injection(P=0.014,*P<0.05)(n=5).

    3.4 CB1R在蝸核中蛋白表達(dá)

    蛋白結(jié)果分析顯示(圖4):SS注射7天后,CB1R在大鼠蝸核中的表達(dá)均有明顯增加(t=2.866,P=0.0457,P<0.05),而在SS注射14天后,CB1R在大鼠蝸核中的表達(dá)均有明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.216,P=0.0324,P<0.05)。

    圖4 水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴模型中CB1R在蝸核中蛋白表達(dá)變化。A:SS注射7天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R蛋白表達(dá)增加(P=0.0457,*P<0.05)(n=5);B:SS注射14天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R蛋白表達(dá)減少(P=0.0324,*P<0.05)(n=5)。Fig.4 Protein expression of CB1R in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A:after 7 days of sodium salicylate injection,CB1R protein expression in the cochlear nucleus of tinnitus rats increased(P=0.0457,*P<0.05)(n=5);B:after 14 days of sodium salicylate injection,CB1R protein expression in the cochlear nucleus of tinnitus rats decreased(P=0.0324,*P<0.05)(n=5).

    3.5 CB1R在蝸核中熒光表達(dá)

    免疫熒光結(jié)果分析顯示(圖5):SS注射7天后,CB1R在大鼠蝸核中的表達(dá)均有明顯增加(t=2.207,P=0.0423,P<0.05),而在SS注射14天后,CB1R在大鼠蝸核中的表達(dá)均有明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.234,P=0.0000,P<0.05)。

    圖5 水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴模型中CB1R在蝸核中平均熒光強(qiáng)度表達(dá)變化。A,C:SS注射7天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R平均熒光強(qiáng)度增加(P=0.0423,*P<0.05)(n=5);B,D:SS注射14天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R平均熒光強(qiáng)度減少(P=0.0000 ,****P<0.0001)(n=5),標(biāo)尺20μm。Fig.5 Changes of CB1R expression in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A,C:after 7 days of sodium salicylate injection,the average fluorescence intensity of CB1R in the cochlear nucleus of tinnitus rats increased(P=0.0423,*P<0.05)(n=5);B,D:after 14 days of sodium salicylate injection,the average fluorescence intensity of CB1R in the cochlear nucleus of tinnitus rats decreased(P=0.0000,****P<0.0001)(n=5),Scale bar:20μm.

    4 討論

    早在1991年早期放射自顯影研究中,CB1R在耳蝸核(CN)中就已被發(fā)現(xiàn)[11];2007年Zheng等人第一次系統(tǒng)性地研究了在大鼠耳蝸核中CB1R空間分布,通過免疫組化法定位CB1R在耳蝸背側(cè)核和腹側(cè)核不同細(xì)胞類型中均有表達(dá),且在水楊酸誘導(dǎo)耳鳴大鼠中發(fā)現(xiàn)腹側(cè)蝸核中CB1R表達(dá)明顯減少[12];2016年Toal K L等人研究顯示CB1R敲除小鼠對(duì)于高頻8kHz~24kHz的聲音辨別能力有明顯缺失[13];2016年Hwang等人研究發(fā)現(xiàn)在小鼠耳鳴模型中,CB1R在蝸核、腦干和下丘、海馬和海馬旁、顳葉以及額葉中均有表達(dá)且表達(dá)明顯降低[14]。以上證據(jù)均證實(shí)CB1R不僅在聽覺系統(tǒng)中必不可少,而且在水楊酸誘導(dǎo)耳鳴的過程中也發(fā)揮著重要的作用。

    CB1R在突觸發(fā)育以及可塑性調(diào)節(jié)中具有重要作用。研究表顯示在聽力開始前(P5)和聽力開始時(shí)(P12)的大鼠中,CB1R調(diào)節(jié)發(fā)育中的MNTB(斜方體中核)-LSO(外側(cè)上橄欖核)突觸的強(qiáng)度[15];除此之外,當(dāng)GABA能神經(jīng)元上CB1R敲除時(shí),小鼠海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元的頂樹突和底樹突的分枝長(zhǎng)度及頂樹突的樹突棘密度均有明顯減少,長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)作用減弱,突觸可塑性被損害;而在谷氨酸神經(jīng)元上CB1R敲除后,錐體神經(jīng)元頂樹突的分枝長(zhǎng)度及樹突棘密度均明顯增加,LTP作用因此增強(qiáng)[16]。王洪田等人在透射電鏡觀察下發(fā)現(xiàn)水楊酸誘導(dǎo)耳鳴大鼠聽皮層突觸形態(tài)學(xué)發(fā)生異常,突觸的數(shù)量、形態(tài)、界面曲率、突觸間隙、面積、活性區(qū)以及突觸后致密物質(zhì)厚度均有明顯增加變化[17]。這些結(jié)果顯示CB1R是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)育調(diào)節(jié)的重要受體之一,而水楊酸誘導(dǎo)耳鳴可能是CB1R參與調(diào)節(jié)突觸重塑改變的過程。

    本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),水楊酸鈉連續(xù)注射7天以及14天誘導(dǎo)耳鳴樣行為的產(chǎn)生。且在蝸核中CB1R在7天耳鳴模型中表達(dá)增加,14天耳鳴模型中CB1R表達(dá)降低。CB1R在14天耳鳴模型中表達(dá)降低這與Zheng等人研究結(jié)果一致,但在隨后更多的研究中顯示CB1R激動(dòng)劑的使用并未緩解耳鳴,反而加重了大鼠耳鳴程度,不適合用于臨床藥物治療[18-22]。這樣結(jié)果的原因可能是相比于抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,可能CB1R對(duì)于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放的抑制作用更強(qiáng)。因此本文研究認(rèn)為CB1R在7天和14天耳鳴模型表達(dá)變化可能原因有兩點(diǎn):一點(diǎn)可能是由于鈣離子內(nèi)流、NMDAR過度興奮繼而CB1R激活,表達(dá)增加,發(fā)揮其抗興奮毒性作用,但CB1R對(duì)GABA釋放抑制作用更強(qiáng),興奮抑制平衡未能恢復(fù),而長(zhǎng)期過強(qiáng)興奮毒性刺激導(dǎo)致CB1R出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié);另一點(diǎn)可能是由于水楊酸誘導(dǎo)耳鳴產(chǎn)生以及維持的過程中CB1R通過介導(dǎo)興奮性以及抑制性遞質(zhì)的釋放誘導(dǎo)突觸后LTP以及LTD產(chǎn)生,導(dǎo)致突觸損害并出現(xiàn)重塑性變化。因此盡管既往研究顯示CB1R具有抗興奮毒性以及神經(jīng)保護(hù)作用,但本次蝸核研究結(jié)果中卻并未發(fā)現(xiàn),CB1R在不同時(shí)間模型中變化反而顯示其可能會(huì)促進(jìn)耳鳴的發(fā)生發(fā)展。

    總之,內(nèi)源性大麻素受體在長(zhǎng)期應(yīng)用水楊酸鈉從而導(dǎo)致耳鳴的發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要的作用,但在這過程中CB1R可能調(diào)節(jié)突觸重塑的機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

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