基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討止瀉散治療小兒遷延性慢性腹瀉的潛在機(jī)制

王丹誼，朱萬青，李 娟，李偉偉，李志峰

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

遷延性慢性腹瀉（persistent and chronic diar?rhea，PCD）是指病程在2 周以上的腹瀉，是兒科的常見疾病與多發(fā)疾病。研究發(fā)現(xiàn)，該病每年造成250萬嬰兒死亡，5 歲以下兒童中每1 000 名兒童死亡率為4.9%［1-2］。在發(fā)展中國家和工業(yè)化國家，持續(xù)性和慢性腹瀉最常見、最重要的原因仍然是腸道感染［3-4］，包括細(xì)菌和病毒感染。一項(xiàng)針對199 名患兒腹瀉標(biāo)本的檢測發(fā)現(xiàn)，病毒檢出率為48.7%，其中輪狀病毒A 是最常見的檢出生物（34.67%），其次是諾如病毒GIIGII（20.6%）；細(xì)菌陽性檢出率為40.2%，最常檢測到彎曲桿菌（22.11%），其次是艱難梭菌毒素 AAB 和沙門氏菌［5］?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，PCD 與體液、細(xì)胞免疫功能降低、腸道菌群失調(diào)、腸黏膜持續(xù)損害、黏膜修復(fù)遲緩等有關(guān)［6-8］。腹瀉病長期反復(fù)發(fā)作，可造成營養(yǎng)不良、貧血等并發(fā)癥，嚴(yán)重會影響兒童的生長發(fā)育，故針對遷延性慢性腹瀉的治療以去除病因，恢復(fù)患兒胃腸生理功能，促進(jìn)生長發(fā)育為原則，但是西醫(yī)治療個(gè)體化不足，臨床療效欠佳。

PCD 屬中醫(yī)“久瀉”“泄瀉”等范疇［9］，中醫(yī)藥治療小兒腹瀉積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，對于遷延性慢性腹瀉采用中醫(yī)辨證施治療效明顯?！队子准伞费裕骸凹芍篂a散治久瀉如神，此方經(jīng)驗(yàn)最多?！笨梢娭篂a散常用來治療久瀉。而止瀉散組方中藥的活性成分較多，說明止瀉散可能是通過多成分的協(xié)同作用而起效，但關(guān)于止瀉散治療PCD 的分子機(jī)制尚未明確。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息，構(gòu)建生物信息網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及選取特定信號節(jié)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)藥物作用多靶點(diǎn)預(yù)測。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略涵蓋了多個(gè)靶點(diǎn)，將藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，可為新藥研發(fā)提供新途徑和新策略［10］。本研究應(yīng)用多個(gè)數(shù)據(jù)庫綜合挖掘和篩選止瀉散組方中藥的活性化學(xué)成分及藥物作用靶點(diǎn)，從而探索止瀉散治療PCD的作用及分子機(jī)制，以期為止瀉散治療PCD的研究提供新思路和新途徑。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件選擇 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www. genecards. org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：// www.omim.org/）、STRING 10.5數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）、UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/uploadlists/）、KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/）、David數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）等以及R軟件、Cytoscape 3.7.2軟件。

1.2 止瀉散組方藥物活性有效成分靶點(diǎn)篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，Tradition?al chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform）是一個(gè)藥理學(xué)平臺，它能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。該數(shù)據(jù)庫包括化學(xué)物質(zhì)、靶點(diǎn)和相關(guān)的藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以及涉及口服生物利用度、類藥性指數(shù)等天然化合物的藥代動力學(xué)特性。 通過訪問TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以“茯苓”“山藥”“車前子”“甘草”為關(guān)鍵詞檢索止瀉散中的化學(xué)成分。在數(shù)據(jù)庫收集止瀉散中的化學(xué)藥效成分信息，選擇口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%［11］，類藥性指數(shù)（drug like index，DL）≥0.18［12］，搜索并篩選該數(shù)據(jù)庫中所包含的止瀉散中藥物的有效活性成分及毒藥物動力學(xué)（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）信息，將所得信息保存為txt 文本格式，并制成三線表。此外，在TC?MSP 在線數(shù)據(jù)庫平臺Ingredients 獲得篩選得到的止瀉散中藥物有效化學(xué)活性成分相對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 通過登陸Gene?Cards和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“persistent and chronic diar?rhea”為關(guān)鍵詞，檢索與PCD 相關(guān)基因靶點(diǎn)，將上述檢索到的基因、靶點(diǎn)結(jié)果進(jìn)行整合，將信息錄入txt文本中，與“1.2”項(xiàng)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行交集比對，利用R軟件包“VennDiagram”包繪制止瀉散中包含藥物靶點(diǎn)與PCD 相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，最終獲得止瀉散治療PCD 的潛在作用靶點(diǎn)，將獲取信息錄入txt文本中。STRING 數(shù)據(jù)庫是一個(gè)儲存已知和預(yù)測未知蛋白質(zhì)相互作用的在線軟件，可對每個(gè)蛋白相互作用信息進(jìn)行評價(jià)分析、賦值，分值越高，可信度越好［13］，從而得出蛋白競相作用的詳細(xì)信息。將“1.2”項(xiàng)所得的止瀉散有效活性成分和潛在作用靶點(diǎn)信息上傳 STRING10.5 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）在線軟件，將限定研究物種設(shè)置為人類，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，點(diǎn)擊exports 選擇“TSV：tab separated values-can be opened in Excel”下載數(shù)據(jù)，并將得到的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，得到止瀉散對PCD 作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.4 有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 運(yùn)用Cy?toscape 3.7.2 軟件工具 MCODE 計(jì)算獲得 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋮?shù)，以邊相連蛋白之間有調(diào)控作用的網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)。本研究基于 Closeness、Degree、Radiality、Betweenness、Clustering Coefficient 等參數(shù)評估各個(gè)節(jié)點(diǎn)在全網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵性，根據(jù)MCODE 的計(jì)算結(jié)果，Score分值越高，蛋白間相互作用可信度越高。

1.5 構(gòu)建“藥物-有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將上述靶點(diǎn)基因以及藥物有效化學(xué)成分和止瀉散藥物組成輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用cytoNCA 插件進(jìn)行分析，篩選止瀉散的核心靶點(diǎn)。

1.6 KEGG 及GO 功能富集 將“1.2”項(xiàng)所獲得的數(shù)據(jù)利用UniProt 數(shù)據(jù)庫的Retrieve/ID mapping 搜索功能，剔除重復(fù)、非人源與不規(guī)范的靶點(diǎn)，經(jīng)檢索和轉(zhuǎn)化操作最終得獲取Gene Symbol，以Gene Symbol的格式導(dǎo)入David 6.8 數(shù)據(jù)庫Functional Annotation Tool 的Upload 中粘貼篩選出的關(guān)鍵基因，以人類全基因組為背景和參照，分別勾選BP（biological pro?cess，BP）、CC（cellular component，CC）、MF（molecu?lar function，MF），分析結(jié)果設(shè)置閾值 EASE<0.05，Count≥4，F(xiàn)DR<0.01，P<0.05［13］，獲得顯著性較高的生物過程和通路富集的結(jié)果，點(diǎn)擊通路名稱可以鏈接到KEGG 數(shù)據(jù)庫查看通路圖及詳情，并將所得信息通過R軟件繪制柱狀圖以及氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 止瀉散中活性成分的篩選與ADME 分析 通過在TCMSP 在線數(shù)據(jù)庫平臺檢索止瀉散中所含中藥活性成分及其ADME 參數(shù)，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18 參數(shù)對上述中藥的有效活性成分進(jìn)行篩選，共篩選出104個(gè)有效藥物活性成分，潛在靶標(biāo)數(shù)共226個(gè)。見表1。

表1 止瀉散中包含中藥的有效活性成分個(gè)數(shù) （個(gè)）

2.2 止瀉散中藥物“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建和分析 將2.1 結(jié)果中的有效活性成分及潛在靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫中，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建止瀉散的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見圖1，此網(wǎng)絡(luò)共178 個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 252 條邊，平均節(jié)點(diǎn)連接度為36.5，平均局部聚類系數(shù)為0.592。

2.3 構(gòu)建“藥物-有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將上述靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用cytoNCA 插件進(jìn)行分析，篩選核心靶點(diǎn)基因，根據(jù)Degree>61，Betweenness>600，LAC>100進(jìn)行篩選出核心基因 MAPK8、MAPK3、JUN、VEGFA、CASP3等，見圖1。將篩選的核心基因與藥物有效化學(xué)成分、藥物靶點(diǎn)組成藥物-疾病-有效活性成分網(wǎng)絡(luò)圖（橢圓形代表有效活性成分、三角形代表靶點(diǎn)），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：止瀉散中藥物的化學(xué)活性成分有11 個(gè)，包 括 MOL005869（daucostero_qt 胡 蘿 卜 苷）、MOL000422（kaempferol 山柰酚）、MOL000273（茯苓酸）、MOL000296（hederagenin-常春藤皂苷元）、MOL000098（quercetin-槲皮素）、MOL000392（for?mononetin-芒柄花黃素）、MOL002311（Glycyrol-甘草酚）、MOL004328（naringenin-柚皮素）、MOL000497（licochalcone a-甘草查爾酮 A）、MOL000546（dios?genin-薯蕷皂苷元）等；靶點(diǎn)有14 個(gè)，包括VEGFA、NOS2、CASP3、JUN、NCOA2、AKT1、IL2、MAPK3、IL6、STAT3、MAPK8、MYC、IL4、EGF等。見圖2。

圖1 止瀉散的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖2 “藥物-有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點(diǎn)生物學(xué)功能分析 將“2.2”結(jié)果中的“活性成分-靶點(diǎn)”分別進(jìn)行GO分析及KEGG 分析，將上述節(jié)點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Protein name 進(jìn)行注釋，注釋結(jié)果導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫，在 DAVID 數(shù)據(jù)庫 Functional Annota?tion Tool 的Upload 中粘貼篩選出的關(guān)鍵基因，以人類全基因組為背景和參照，分析結(jié)果設(shè)置閾值：EASE<0.05，Count≥4，F(xiàn)DR<0.01，P<0.05，獲得顯著性較高的生物過程和通路富集的結(jié)果，點(diǎn)擊通路名稱可以鏈接到GO 數(shù)據(jù)庫及KEGG 數(shù)據(jù)庫查看詳情。經(jīng)R 語言運(yùn)行后，將顯著性高的生物過程和通路繪制成GO 功能富集的氣泡圖，P 值代表富集的顯著性，相應(yīng)的P 值也越小，其顏色越偏向紅色，反之顏色偏向藍(lán)色；橫坐標(biāo)表示富集數(shù)目；運(yùn)行R 程序后，將靶點(diǎn)富集最多的信號通路經(jīng)R 程序繪制KEGG 通路富集分析柱狀圖，P 值代表富集的顯著性，相應(yīng)的P 值也越小，其顏色越偏向紅色，反之顏色偏向藍(lán)色。GO 分析結(jié)果顯示：得出10 個(gè)生物過程（biologi?cal process，BP），包括氧化應(yīng)激、肽基酪氨酸磷酸化、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)等；10 個(gè)細(xì)胞組份（cellular compo?nent，CC）；包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、血小板α 顆粒、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等；10 個(gè)分子功能（molecular function，MF）；包括細(xì)胞因子活性、生長因子活性、受體配體活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、MAP 激酶活性、胰島素受體結(jié)合等。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，止瀉散治療效果涉及到乙型肝炎（Hepatitis B）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvi?rus infection）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomega?lovirus infection）、耶爾森氏菌感染（Yersinia infec?tion）、沙門氏菌感染（Salmonella infection）、愛潑斯坦巴爾病毒感染（Epstein?Barr virus infection、致病性大腸桿菌感染（Pathogenic Escherichia coli infection）等與細(xì)菌感染有關(guān)的疾病，其涉及通路除MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE?RAGE signaling path?way in diabetic complications）等通路比較明顯外，另外還得到C型凝集素受體信號通路（C?type lectin re?ceptor signaling pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL?17 signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signal?ing pathway）、HIF-1 信號通路（HIF?1 signaling path?way）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）。見圖3、圖4。

圖3 止瀉散治療PCD的GO分析氣泡圖及KEGG通路分析柱狀圖

圖4 核心靶點(diǎn)-通路圖

3 討 論

小兒泄瀉的主要病因病機(jī)在于小兒脾常不足，脾胃虛弱，后天復(fù)感濕邪，濕邪阻滯，導(dǎo)致脾虛失運(yùn)，水谷精微留滯腸腑，甚至腸道脂膜損傷，水濕不化，故而發(fā)為泄瀉；久瀉不愈則脾虛及腎，后天水谷精微不化，氣血生化乏源，以致脾腎兩虛［14-15］?！队子准伞分篂a散由茯苓、山藥、車前子、甘草四味藥組成。臨床中止瀉散治療PCD 具有良好的臨床療效，但未見有文獻(xiàn)報(bào)道止瀉散治療PCD的作用機(jī)制研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不止針對單一化學(xué)成分對疾病的作用，而是融合了中醫(yī)藥辨證和整體的思維方法，因而對研究中藥復(fù)方的作用闡釋具有明顯優(yōu)勢。

本研究篩選出了止瀉散中104 個(gè)有效活性成分，潛在靶標(biāo)數(shù)共226 個(gè)，構(gòu)建了藥物-有效活性成分-核心靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)，確定了復(fù)方中11 個(gè)有效活性成分及9 個(gè)疾病共同的核心作用靶點(diǎn)。隨后進(jìn)行GO 分析和 KEGG 富集分析，GO 分析結(jié)果顯示，止瀉散通過直接或間接作用于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、血小板等多個(gè)細(xì)胞組分，通過介導(dǎo)細(xì)胞因子活性、生長因子活性、多種酶的結(jié)合等，參與氧化應(yīng)激、肽基酪氨酸磷酸化等生物學(xué)過程。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，止瀉散主要治療與卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、耶爾森氏菌感染、沙門氏菌感染、致病性大腸桿菌感染等與細(xì)菌、病毒感染有關(guān)的疾病。提示遷延性腹瀉大多與細(xì)菌感染、病毒感染相關(guān)。腸道中的厭氧菌可以抑制腸道中炎癥物質(zhì)的釋放，減輕腸道中的炎癥反應(yīng)，從而增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能。兒童患遷延性腹瀉時(shí)，糞便中的厭氧菌相對于正常糞便明顯減少，則相應(yīng)的需氧菌就會明顯增多。因?yàn)樾禾幱谏L發(fā)育階段，其腸道的免疫與消化功能還不完善，同時(shí)小兒腸道中微生物群也處于生理性演替階段，使得腸道各功能不穩(wěn)定，所以小兒腸道菌群紊亂容易發(fā)生，而腹瀉等疾病使得腸道內(nèi)厭氧菌大量減少，導(dǎo)致腸道屏障和拮抗作用減弱，兒童腸道免疫功能尚不完善，病原菌更容易侵襲與繁殖，從而加重腹瀉的發(fā)生。止泄散治療遷延性腹瀉可能是作用于需氧菌的產(chǎn)生，促進(jìn)厭氧菌在腸道的生長，抑制腸道中炎癥物質(zhì)的釋放，減輕腸道中的炎癥反應(yīng)，從而增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能，治療遷延性腹瀉。

富集分析提示止瀉散有效成分作用于靶點(diǎn)可能通過調(diào)節(jié)MAPK、AGE-RAGE、C 型凝集素受體、IL-17、T細(xì)胞受體、HIF-1、FoxO等信號通路來發(fā)揮治療作用。既往研究表明，MAPK 信號通路作為重要的信號通路之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長等生理病理過程［16］。C 型凝集素受體信號通路不僅參與免疫調(diào)節(jié)［17］，而且可以介導(dǎo)抗真菌感染等［18］。、IL-17 信號通路在介導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫過程中成為自身免疫病研究的新方向［19］，同時(shí)又可以參與抗病毒的調(diào)節(jié)過程［20］。HIF-1 信號通路在氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用［21］。在核心靶點(diǎn)-通路圖中，MAPK3、AKT1、JUN、IL6、MAPK8、TNF、CXCL8與通路的相關(guān)性最強(qiáng)。由此可見，止泄散治療遷延性腹瀉可能的機(jī)制是作用于MAPK3、AKT1、JUN、IL6、MAPK8、TNF、CXCL8 等蛋白靶點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)MAPK、IL-17、T細(xì)胞受體、HIF-1、FoxO 等通路，抑制腸道中炎癥物質(zhì)的釋放，減輕腸道中的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能，從而達(dá)到治療遷延性腹瀉的目的。

最后經(jīng)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析確定復(fù)方作用于疾病的核心靶點(diǎn)，止瀉散中包含甘草、茯苓、山藥、車前子四味藥，這些藥物有效成分作用于疾病核心靶點(diǎn)的化合物包括胡蘿卜苷、山柰酚、茯苓酸、常春藤皂苷元、槲皮素、芒柄花黃素、甘草酚、柚皮素、甘草查爾酮A、薯蕷皂苷元。既往研究表明，甘草的有效成分如山柰酚、槲皮素、柚皮素、甘草查爾酮A 均屬于黃酮類物質(zhì)，有抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫的功效［22-23］。茯苓首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有利水滲濕功效，可用于脾虛食少、便溏泄瀉等癥［24］，研究證實(shí)其有效成分如茯苓酸、常春藤皂苷元有抗炎、抗菌的作用［25］。山藥的有效成分如薯蕷皂苷元，作為天然甾體皂苷元，具有很強(qiáng)的抗感染、抗過敏作用，并可消除腸道炎癥［26-27］。相關(guān)研究表明車前子中多糖成分有縮短腹瀉病程的功效［28］。因此，研究推測，止瀉散可能通過其有效成分胡蘿卜苷、山柰酚、茯苓酸、常春藤皂苷元、槲皮素、芒柄花黃素、甘草酚、柚皮素、甘草查爾酮A、薯蕷皂苷元等作用于生長因子、炎性細(xì)胞因子、多種蛋白酶等靶點(diǎn)，從而調(diào)控MAPK、AGERAGE、C 型凝集素受體、IL-17、T 細(xì)胞受體、HIF-1、FoxO 等信號通路發(fā)揮治療PCD 的作用。同時(shí)也提示了止瀉散多成分、多靶點(diǎn)和多途徑治療PCD 的作用特點(diǎn)，可為闡明止瀉散治療PCD 的機(jī)制提供新思路和方法。