基于譜效關(guān)聯(lián)分析篩選竹葉椒揮發(fā)油抗菌質(zhì)量標(biāo)志物

李毛加，沙玉茹，羅曉敏，龔普陽，顧 健

西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

竹葉椒又稱萬花針、崖椒、蜀椒或藤椒等[1]，是蕓香科花椒屬植物竹葉椒Zanthoxylum armatumDC.的果實(shí)，氣香、味微甜而辛[2]。竹葉椒最早記載于《本草圖經(jīng)》，其種質(zhì)資源豐富，廣泛分布于我國四川、云南、貴州、西藏等地。由于竹葉椒具有溫中燥濕、散寒止痛、驅(qū)蟲止癢等功效[3]，被廣泛用于醫(yī)藥、食品、衛(wèi)生、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。竹葉椒的藥用部位為根、莖、葉、果實(shí)，根莖含有多種生物堿、木脂素等成分，果實(shí)主要富含揮發(fā)油。揮發(fā)油是竹葉椒藥效物質(zhì)組分之一，主要包含萜類、酮類、醛類、酯類、醇類等多種化合物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，花椒屬植物揮發(fā)油具有作為鎮(zhèn)痛劑、抗氧化劑及抑菌藥物的潛質(zhì)[5]。課題組前期對(duì)竹葉椒不同部位進(jìn)行抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)竹葉椒揮發(fā)油部位抗菌效果最佳[6]。因此，本研究通過建立不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜，結(jié)合抗菌活性評(píng)價(jià)，采用聚類分析法[7]、主成分分析法[8]以及灰色關(guān)聯(lián)分析法[9]，進(jìn)一步研究其抗菌質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）[10]，為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

采購不同產(chǎn)地竹葉椒（S1～S10），經(jīng)西南民族大學(xué)藥學(xué)院顧健教授鑒定均為蕓香科花椒屬植物竹葉椒Z.armatumDC.的果實(shí)。

1.2 菌株

大腸桿菌（編號(hào)45977）、金黃色葡萄球菌（編號(hào)45986）、紅色毛癬菌（編號(hào)340195）、須鮮毛癬菌（編號(hào)340405）購自北京北納生物科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

醋酸乙酯（批號(hào)20191112）、無水硫酸鈉（批號(hào)20200612）、鹽酸（批號(hào)20200311）、比濁管（批號(hào)20190522）購自天津化學(xué)試劑有限公司；石油醚（批號(hào)20191212）購自科龍化學(xué)有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)20200812）、生理鹽水（批號(hào)20200111）、無水硫酸鈉（批號(hào)20200313）、無水乙醇（批號(hào)20201112）購自天津福晨化學(xué)試劑有限公司；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)20190783）、肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)20188771）購自北京北納生物科技有限公司。

1.4 儀器

7980B 5977C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SB-4200D型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MH-2000型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；ZWY-200D型智誠恒溫培養(yǎng)振蕩器、CHP-8型恒溫培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 竹葉椒揮發(fā)油的制備

稱取竹葉椒80 g，加入1.6 L水和數(shù)粒玻璃珠混合均勻，于電熱套上緩慢加熱至沸騰，保持微沸1 h，用無水硫酸鈉吸收揮發(fā)油中殘留水，即得竹葉椒揮發(fā)油。

2.2 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品的制備 稱取適量10批不同產(chǎn)地的竹葉椒揮發(fā)油，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為38.46 mg/mL的供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 DB-5色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；氣化室溫度為280 ℃；分流比為100∶1；進(jìn)樣量為1 μL；載氣為氦氣；色譜柱初始溫度為40 ℃，以15 ℃/min升溫至70 ℃，繼續(xù)以0.5 ℃/min升至73 ℃；以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；以20 ℃/min升至300 ℃，保持20 min。

2.2.3 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；掃描范圍為m/z20～600；電離電壓為70 eV。

2.3.4 竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜的建立 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，進(jìn)樣測定。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版），以S1批次樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，得到10批竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜。

2.3.5 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油相似度分析及共有峰的指認(rèn) 將10批竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜保存為AIA格式，用2004A版指紋圖譜相似度軟件，對(duì)10批竹葉椒揮發(fā)油色譜指紋峰進(jìn)行匹配。以S1批次樣品的指紋圖譜為保留時(shí)間參考標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配，自動(dòng)匹配共生成16個(gè)共有峰，計(jì)算相似度。

2.3.6 聚類分析和主成分分析 將10批竹葉椒揮發(fā)油峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S10批次供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，RSD均為2.0%～2.6%，表明樣品穩(wěn)定性較好。

2.4.2 儀器精密度試驗(yàn) 取S10批次供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，色譜峰峰面積RSD均小于2.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 方法重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備6份S10批次供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜峰峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 竹葉椒揮發(fā)油抗菌實(shí)驗(yàn)

2.5.1 供試品的制備 適量稱取10批不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油，用DMSO溶液配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的供試品溶液。

2.5.2 菌懸液的制備 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，加入4 mL肉湯培養(yǎng)基。將菌懸液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，于搖床搖晃4 h得到菌懸液，靜置10 min。

將紅色毛癬菌、須鮮毛癬菌分別劃線接種于SDA平板，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，向斜面加入3 mL無菌生理鹽水，用接種環(huán)刮取。將菌懸液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，于渦旋儀渦旋1 min，得到菌懸液，靜置10 min。用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基稀釋成1×106cfu/mL的接種菌液。

2.5.3 含藥濾紙片的制備 用打孔器把定性濾紙制成6 mm的圓形紙片，高壓滅菌后，將其浸泡于竹葉椒揮發(fā)油供試品中。

2.5.4 含菌平板的制備 用涂布棒分別將200 μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、紅色毛癬菌和須鮮毛癬菌的菌懸液均勻涂布于固體平板上，晾干。將平板分成3個(gè)區(qū)域并標(biāo)記，用鑷子將含藥濾紙鋪于平板標(biāo)記區(qū)域，將平板倒置，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察抑菌效果，測量抑菌圈。

2.6 結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法分析竹葉椒揮發(fā)油譜效關(guān)系

灰色關(guān)聯(lián)分析法是建立中藥譜效關(guān)系的常用方法之一?；疑P(guān)聯(lián)分析法是通過計(jì)算指紋圖譜共有特征峰與藥效之間關(guān)聯(lián)度的大小，以確定各共有特征峰對(duì)藥效的貢獻(xiàn)值[11-12]。本研究以金黃色葡糖球菌抑菌圈、大腸桿菌抑菌圈、紅色毛癬菌抑菌圈、須鮮毛癬菌抑菌圈直徑為參考序列，10批竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜共有峰的峰面積為比較序列，采用灰色關(guān)聯(lián)分析法，先將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化處理，再求得絕對(duì)差序列、關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度，最終確定關(guān)聯(lián)度。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油含量

如表1所示，云南邵通、水富、黃華、華平4個(gè)地區(qū)竹葉椒揮發(fā)油含量為50.0～102.5 mL/kg；四川達(dá)州、漢源、南部、金陽4個(gè)地區(qū)竹葉椒揮發(fā)油含量為60.0～100.0 mL/kg；貴州遵義竹葉椒揮發(fā)油含量為115.0 mL/kg；重慶江津竹葉椒揮發(fā)油含量為68.8 mL/kg，表明不同產(chǎn)地的竹葉椒揮發(fā)油含量存在差異。

表1 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油含量Table 1 Contents of volatile oil of Z.armatum from different areas

3.2 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜

不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜如圖1所示，通過氣-質(zhì)數(shù)據(jù)庫NIST08.LIB數(shù)據(jù)匹配對(duì)16個(gè)共有峰進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果如表2所示。其中，經(jīng)面積歸一化法測定各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示芳樟醇、檸檬烯及檜烯3種化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

表2 竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜化學(xué)成分鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of chemical constituents of volatile oil of Z.armatum

圖1 10批竹葉椒揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜 (A) 和對(duì)照?qǐng)D譜 (B)Fig.1 GC-MS fingerprint of volatile oil of Z.armatumin in 10 batches (A) and reference substance fingerprint (B)

3.3 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油相似度分析

如表3所示，S1～S10批次間竹葉椒揮發(fā)油的相似度均大于0.97，表明10批竹葉椒揮發(fā)油具有高度的一致性和穩(wěn)定性。

表3 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油相似度Table 3 Similarity of volatile oil of Z.armatum from different areas

3.4 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜聚類分析

根據(jù)10批竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜特征峰的峰面積進(jìn)行聚類分析，如圖2所示，所有樣品被分成2類，第1類包括S7、S8、S9、S10批次；第2類包括S1、S2、S3、S4、S5、S6批次。四川漢源、四川南部、四川金陽、貴州遵義竹葉椒揮發(fā)油聚為1類；云南華平、云南邵通、云南水富、云南黃華、四川達(dá)州、重慶江津竹葉椒揮發(fā)油聚為1類，表明云南各地區(qū)竹葉椒品種相似，四川達(dá)州與四川漢源、南部和金陽地區(qū)竹葉椒品種具有差異；四川達(dá)州和重慶江津與云南各地區(qū)竹葉椒聚為一類；貴州遵義與四川各地區(qū)產(chǎn)地聚為一類，表明不同產(chǎn)地竹葉椒品種具有相似性。

圖2 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油聚類分析Fig.2 Cluster analysis of volatile oil of Z.armatum from different areas

3.5 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜主成分分析

如圖3所示，不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油主成分分析綜合得分排序?yàn)榉颊链迹緳幟氏緳u烯，表明芳樟醇可以作為竹葉椒揮發(fā)油質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。

圖3 竹葉椒揮發(fā)油主成分綜合得分Fig.3 Comprehensive score of main components of volatile oil of Z.armatum

3.6 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油抑菌活性評(píng)價(jià)

如表4所示，不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用排序?yàn)镾1＞S2＞S8＞S4＞S3＞S9＞S7＞S5＞S6＞S10；不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的抑菌作用排序?yàn)镾9＞S4＞S7＞S8＞S1＞S6＞S10＞S3＞S2＞S5；不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油對(duì)紅色毛癬菌的抑菌作用排序?yàn)镾5＞S8＞S4＞S7＞S2＞S6＞S10＞S9＞S1＞S3；不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油對(duì)須鮮毛癬菌的抑菌作用排序?yàn)镾5＞S4＞S2＞S10＞S6＞S8＞S7＞S9＞S1＞S3。表明不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、紅色毛癬菌、須鮮毛癬菌均有較好的抑制作用，其中云南華平產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳；四川金陽產(chǎn)地的竹葉椒揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌抑菌效果最佳，四川達(dá)州產(chǎn)地的竹葉椒揮發(fā)油對(duì)紅色毛癬菌和須鮮毛癬菌的抑菌效果最佳。

表4 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油抑菌圈直徑 ( ±s , n=3)Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of volatile oil of Z.armatum from different areas ( ±s , n=3)

表4 不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油抑菌圈直徑 ( ±s , n=3)Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of volatile oil of Z.armatum from different areas ( ±s , n=3)

批次 抑菌圈直徑/mm金黃色葡萄球菌 大腸桿菌 紅色毛癬菌 須鮮毛癬菌S1 26.56±0.18 21.09±2.19 14.97±0.71 10.16±0.09 S2 24.00±1.13 18.83±1.91 21.39±0.95 13.59±0.63 S3 19.65±1.73 19.35±0.68 13.08±0.49 9.23±0.48 S4 20.79±2.53 24.80±0.69 22.40±1.00 14.40±0.82 S5 18.66±2.17 14.35±0.84 23.29±0.79 15.88±0.66 S6 17.24±1.79 19.67±1.51 19.71±0.41 13.08±0.79 S7 18.84±0.67 23.65±0.21 21.74±0.94 12.67±0.42 S8 22.57±2.07 23.31±0.46 23.24±0.64 12.97±0.76 S9 19.13±0.15 26.05±1.23 15.03±0.72 10.47±0.58 S10 15.00±1.09 19.52±0.46 18.16±0.79 13.58±0.82

3.7 結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)法分析竹葉椒揮發(fā)油譜效關(guān)系

如表5所示，竹葉椒揮發(fā)油共有峰與金黃色葡萄球菌抗菌作用的貢獻(xiàn)關(guān)聯(lián)度均大于1.41。其中色譜峰6（檸檬烯）與抑制金黃色葡萄球菌相關(guān)性最強(qiáng)，關(guān)聯(lián)度為1.931；各色譜峰與大腸桿菌關(guān)聯(lián)度均大于0.78，其中色譜峰11（芳樟醇）與抑制大腸桿菌關(guān)聯(lián)度較高。竹葉椒揮發(fā)油共有峰與抗紅色毛癬菌作用的關(guān)聯(lián)度均大于0.74，其中色譜峰11（芳樟醇）是抑制紅色毛癬菌關(guān)聯(lián)度最強(qiáng)的色譜峰，其次為色譜峰12（側(cè)柏酮）；各色譜峰與抗須鮮毛癬菌作用關(guān)聯(lián)度均大于0.73，其中色譜峰11（芳樟醇）與色譜峰12（側(cè)柏酮）較高。綜合灰色關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，檸檬烯、芳樟醇、側(cè)柏酮是竹葉椒揮發(fā)油中主要的抗菌潛在活性成分。

表5 竹葉椒揮發(fā)油色譜峰與抑菌作用的關(guān)聯(lián)度Table 5 Correlation degree between chromatographic peak and antibacterial effect of volatile oil of Z.armatum

4 討論

竹葉椒作為花椒的亞屬，是食品或保健食品開發(fā)的重要原料[13]，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系構(gòu)建尚未完善。為構(gòu)建完善的的竹葉椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，將其揮發(fā)油主要成分與功效相對(duì)應(yīng)，本研究通過建立不同產(chǎn)地竹葉椒揮發(fā)油指紋圖譜，通過GC-MS定性分析，鑒定出16個(gè)共有峰的化學(xué)成分，并采用聚類分析以及主成分分析法，分析出同一地區(qū)不同產(chǎn)地的竹葉椒品種存在差異性。通過計(jì)算主成分綜合得分，發(fā)現(xiàn)芳樟醇與檸檬烯是其最主要的化學(xué)成分，提示芳樟醇和檸檬烯可在不同產(chǎn)地竹葉椒質(zhì)量區(qū)分中發(fā)揮重要的作用，可作為其Q-Marker的潛在候選化合物。

竹葉椒主要成分為檸檬烯、芳樟醇等揮發(fā)性物質(zhì)，檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有抑制作用[14-16]，芳樟醇對(duì)紅色毛癬菌、須鮮毛癬菌具有抑制作用[17]，表明竹葉椒揮發(fā)油中的多種成分可能通過協(xié)同作用發(fā)揮抗菌作用。本研究根據(jù)竹葉椒臨床適應(yīng)證特點(diǎn)，選擇了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、紅色毛癬菌和須鮮毛癬菌進(jìn)一步確證竹葉椒揮發(fā)油的抑菌作用。為進(jìn)一步篩選竹葉椒揮發(fā)油的抗菌活性成分，借助灰色關(guān)聯(lián)分析法發(fā)現(xiàn)檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌可能存在較強(qiáng)的抑制作用，芳樟醇與側(cè)柏酮對(duì)大腸桿菌、紅色毛癬菌及須鮮毛癬菌具有較好的抑制活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)竹葉椒揮發(fā)油的抗菌作用來源于多種成分，芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏酮可能為竹葉椒的抗菌Q-Marker，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)以及控制提供了一定的數(shù)據(jù)支持與理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突