復(fù)方阿膠漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

許 嘯 ，張 淹，劉曉云，王 宇，劉 越，董 英，宋若蘭，于啊香，馬嘉慕，折改梅*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102

2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 ?？?571101

3.東阿阿膠股份有限公司國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城 252201

中藥復(fù)方制劑藥味復(fù)雜，化學(xué)成分種類繁多，其有效、專屬的質(zhì)量可控是其發(fā)展的關(guān)鍵因素。當(dāng)前，很多中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制方法存在著僅對部分藥味鑒別和缺乏活性成分或者專屬性成分的含量測定等不足。因此，中藥復(fù)方制劑采用全藥味鑒別以及有效、特征和專屬的成分含量測定等質(zhì)控思路得到廣大科學(xué)家的認(rèn)可[1-2]。

復(fù)方阿膠漿（Fufang E’jiao Jiang，F(xiàn)EJ），原方出自明代《景岳全書》中“兩儀膏”，由動(dòng)物藥阿膠和4味植物藥紅參、熟地黃、黨參、山楂組成?！吨袊幍洹?020年版復(fù)方阿膠漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收錄了阿膠、紅參、黨參、山楂的鑒別方法和總氮量含量測定方法[3]。本研究鑒于國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707300）全藥味整體質(zhì)控的思路，將一板多鑒法（identification of multi-herbal medicines by a single-thin layer chromatography，IMMS）和一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）用于復(fù)方阿膠漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究。

IMMS是復(fù)方制劑中不同藥味使用不同或相同的供試品溶液，在相同薄層色譜條件（吸附劑、展開劑）、使用相同/不同顯色方法進(jìn)行鑒別，可實(shí)現(xiàn)在一塊薄層板上同時(shí)鑒別多個(gè)藥味?！吨袊幍洹?020年版中，IMMS在牛黃解毒片、清腦降壓片等復(fù)方制劑中得到了應(yīng)用[3]。本研究采用IMMS法建立了復(fù)方阿膠漿中植物來源中藥的薄層色譜鑒別，即“4-3-2-2”模式，4味中藥、3種供試品溶液制備方法、2種展開劑、2種對照物的雙對照方法，以相對較少的薄層色譜試驗(yàn)次數(shù)，進(jìn)行有效鑒別。

《中國藥典》2020年版規(guī)定阿膠藥材使用L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4種氨基酸進(jìn)行含量測定[3]。以藥材含量測定指標(biāo)性成分為依據(jù)建立復(fù)方制劑含量測定方法，是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定較為認(rèn)可的方法。本研究在建立復(fù)方阿膠漿4種氨基酸含量測定的基礎(chǔ)上，根據(jù)L-羥脯氨酸與其他成分的相對校正因子，通過測定L-羥脯氨酸以計(jì)算甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，達(dá)到一測多評的目的，在一定程度上解決對照品緊缺和檢測成本高的問題[4]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

華譜科儀Acc horm S6000高效液相色譜儀，配備在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器，華譜科儀(北京)科技有限公司；Waters e2695高效液相色譜，配備在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV-Vis檢測器，沃特世科技（上海）有限公司；島津Nexera LC-40高效液相色譜，配備在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Linomat-5半自動(dòng)點(diǎn)樣臺，Reportstar薄層色譜攝像系統(tǒng)，瑞士CAMAG公司；BT25S十萬分之一電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TD5A-WS臺式離心機(jī)，常州市萬合儀器制造有限公司；8302恒溫水浴鍋，上海利浦自動(dòng)化儀表廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101FXB-2電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海樹立儀器儀表有限公司。

Welch Ultimate AQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters T-nature C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。硅膠G薄層板（批號HX87113742），購自德國Merck公司。

1.2 試藥

對照藥材紅參（批號121045-201806）、黨參（批號121057-201206）、熟地黃（批號121196-202007）、山楂（批號121626-201402）及對照品人參皂苷Rg1（批號110703-201832，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）、黨參炔苷（批號111732-201908）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）、牡荊素鼠李糖苷（批號111668-200602）、L-羥脯氨酸（批號111578-201602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%）、甘氨酸（批號140689-202006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）、丙氨酸（批號140680-202005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%）、脯氨酸（批號140677-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈，批號204197，購自美國Fishier Scientific公司，為色譜純；異硫氰酸苯酯（PITC），批號C11507973，購自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。超純水由實(shí)驗(yàn)室Millipore Synergy超純水系統(tǒng)自制。

1.3 樣品

復(fù)方阿膠漿（批號1905075、1907011、1907012、1907014、1907015、1907017、1907020、1907021、1907022、1909004、1909007、1909010、1909011、1909013、1909015、1909016）以及批號為1905075批次所對應(yīng)的紅參陰性樣品、黨參陰性樣品、熟地黃陰性樣品、山楂陰性樣品均由東阿阿膠股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 IMMS薄層色譜鑒別的建立

2.1.1 紅參、黨參 取本品20 mL，用水飽和正丁醇振搖萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液。用氨試液30 mL洗滌，棄去水液。再用正丁醇飽和水30 mL洗滌，棄去水液。正丁醇液回收至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅參對照藥材1 g、黨參對照藥材1 g，分別加水50 mL，超聲處理45 min，濾過，水液濃縮至20 mL，自“用水飽和正丁醇振搖萃取3次”，同法制成對照藥材溶液；再取人參皂苷Rg1、黨參炔苷對照品適量，分別加甲醇制成含0.5 mg/mL的對照品溶液。

取3批復(fù)方阿膠漿（批號1905075、1907011、1907012）及對應(yīng)批次的紅參陰性樣品、黨參陰性樣品各20 mL，自“用水飽和正丁醇振搖萃取3次”，同法分別制成供試品溶液1～3、紅參陰性對照溶液、黨參陰性對照溶液。

照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液2～6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）的下層溶液為展開劑，連續(xù)展開3次，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對照色譜相應(yīng)的位置上，無斑點(diǎn)干擾，表明該方法專屬性、重復(fù)性良好。見圖1。

圖1 復(fù)方阿膠漿中紅參、黨參薄層色譜圖Fig.1 TLC of GRRR and CR in FEJ

2.1.2 熟地黃、山楂

（1）熟地黃供試品溶液的制備：取本品20 mL，加甲醇50 mL，離心，上清液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用醋酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，回收至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取熟地黃對照藥材1 g，加水50 mL，超聲處理45 min，濾過，濾液濃縮至20 mL，自“加甲醇50 mL”，同法制成對照藥材溶液；再取毛蕊花糖苷適量，分別加甲醇制成含0.5 mg/mL的溶液，作對照品溶液。

（2）山楂供試品溶液的制備：取本品50 mL，加聚酰胺（30～60目）6 g，混勻，靜置30 min，用脫脂棉濾過，聚酰胺用水洗脫至近無色，加乙醇50 mL，超聲處理10 min，濾過，回收至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取山楂對照藥材1 g，加水50 mL，超聲處理45 min，濾過，自“加聚酰胺（30～60目）6 g”，同法制成對照藥材溶液；再取牡荊素鼠李糖苷適量，分別加甲醇制成含0.5 mg/mL的溶液，作對照品溶液。

取3批復(fù)方阿膠漿（批號1905075、1907011、1907012）及對應(yīng)批次的熟地黃陰性樣品，自“加甲醇50 mL”，同法分別制成熟地黃供試品溶液1～3、熟地黃陰性對照溶液。再取3批復(fù)方阿膠漿（批號1905075、1907011、1907012），及對應(yīng)批次的山楂陰性樣品50 mL，自“加聚酰胺（30～60目）6 g”，分別同法制成山楂供試品溶液1～3、山楂陰性對照溶液。

照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液2～8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶2∶0.2）為展開劑，連續(xù)展開3次，取出，晾干，置紫外燈光（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與熟地黃對照藥材和毛蕊花糖苷對照品色譜對應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；熟地黃陰性對照色譜相應(yīng)的位置上，無斑點(diǎn)干擾，表明該方法專屬性、重復(fù)性良好。見圖2-A。

再噴以三氯化鋁試液，置紫外燈光（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與山楂對照藥材和牡荊素鼠李糖苷對照品色譜對應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；山楂陰性對照色譜相應(yīng)的位置上，無斑點(diǎn)干擾，表明該方法專屬性、重復(fù)性良好。見圖2-B。

圖2 復(fù)方阿膠漿中熟地黃和山楂薄層色譜圖Fig.2 TLC of RRP and CF in FEJ

2.2 QAMS阿膠含量測定的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Welch Ultimate AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉溶液（用醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）（7∶93）為流動(dòng)相A，以乙腈-水（4∶1）為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～11.0 min，100%～93% A；11.0～13.9 min，93%～88% A；13.9～14.0 min，88%～85% A；14.0～29.0 min，85%～66% A；29.0～30.0 min，66%～0% A；體積流量1 mL/min；柱溫43 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量5 μL。理論板數(shù)按L-羥脯氨酸峰計(jì)算不低于4000，色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品 (A)、復(fù)方阿膠漿供試品 (B) 和陰性樣品(C) 的色譜圖Fig.3 HPLC of mixed reference substances (A), FEJ sample(B), and blank sample (C)

2.2.2 供試品溶液的制備 取復(fù)方阿膠漿（批號1905075）1支，搖勻，精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置于頂空瓶中，加鹽酸2 mL，加蓋密封，于150 ℃水解1 h，放冷，移至蒸發(fā)皿中，用水10 mL分次洗滌頂空瓶，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，過濾，即得。

精密量取上述供試品溶液5 mL，分別置25 mL量瓶中，各加0.1 mol/L PITC的乙腈溶液2.5 mL，1 mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10 mL，加正己烷10 mL，振搖，放置10 min，取下層溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 取L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸對照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成分別含L-羥脯氨酸40μg/mL、甘氨酸80 μg/mL、丙氨酸40 μg/mL、脯氨酸60 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

精密量取上述混合對照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L PITC的乙腈溶液2.5 mL，1 mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10 mL，加正己烷10 mL，振搖，放置10 min，取下層溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取按“2.2.3”項(xiàng)方法制成的含L-羥脯氨酸0.438 mg/mL、甘氨酸0.774 mg/mL、丙氨酸0.401 mg/mL、脯氨酸0.572 mg/mL的混合對照品溶液。取該混合對照品溶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液分別稀釋0、5、10、25、50倍，自“2.2.3”項(xiàng)中“精密量取上述溶液5 mL”進(jìn)行操作，即得系列質(zhì)量濃度溶液。分別進(jìn)樣5 μL，測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4個(gè)氨基酸成分的峰面積，以質(zhì)量濃度（X）對色譜峰面積（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得4種成分回歸方程分別為L-羥脯氨酸Y＝3×107X＋2 596.6，r＝1.000 0，線性范圍1.75～87.60 μg/mL；甘氨酸Y＝4×107X－4 790.7，r＝1.000 0，線性范圍3.10～155.00 μg/mL；丙氨酸Y＝3×107X＋13 876，r＝0.999 8，線性范圍1.60～80.20 μg/mL；脯氨酸Y＝3×107X＋6 372.65，r＝1.000 0，線性范圍2.29～114.00 μg/mL；結(jié)果表明，各氨基酸在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（批號1905075），連續(xù)進(jìn)樣6次，測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4個(gè)氨基酸成分，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為1.02%、1.27%、1.22%、1.15%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號1905075），分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4個(gè)氨基酸成分，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為1.24%、1.25%、1.37%、1.33%，表明24 h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方阿膠漿（批號1905075）6份，分別制備供試品溶液，測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4個(gè)氨基酸成分，結(jié)果各成分質(zhì)量濃度的RSD分別為1.55%、1.96%、2.30%、1.51%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已測定的復(fù)方阿膠漿（批號1905075）6份，精密加入與樣品中待測成分含量相當(dāng)?shù)陌被峄旌蠈φ掌啡芤?，依法提取測定，計(jì)算各成分的回收率。結(jié)果表明，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的平均回收率分別為97.30%、94.10%、93.98%、97.91%，RSD分別為2.35%、1.59%、2.14%、1.83%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.9 QAMS的建立

（1）相對校正因子（relative correction factor，RCF）的測定：阿膠中的主要成分是膠原蛋白，L-羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸，其含量在膠原蛋白中比例基本固定[11]，因此，選用L-羥脯氨酸作為內(nèi)參物，根據(jù)L-羥脯氨酸與其他成分的RCF來計(jì)算其他成分的含量。

取“2.2.4”項(xiàng)下的系列濃度的混合對照品溶液，即得對照品母液（I）、稀釋5倍對照品溶液（II）、稀釋10倍對照品溶液（III）、稀釋25倍對照品溶液（IV）、稀釋50倍對照品溶液（V），分別進(jìn)樣。以公式fs/i＝fs/fi＝AsCi/AiCs（式中As為內(nèi)參物對照品峰面積，Cs為內(nèi)參物對照品質(zhì)量濃度，Ai為待測成分對照品峰面積，Ci為某待測成分對照品質(zhì)量濃度），分別計(jì)算L-羥脯氨酸與甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的RCF分別為0.643、0.939、0.870，RSD分別為2.19%、2.96%、1.89%。

（2）不同進(jìn)樣量對RCF的影響：考察了在不同進(jìn)樣量2、4、5、8、10 μL對RCF的影響。結(jié)果（表1）表明，不同進(jìn)樣量下，L-羥脯氨酸與甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的RCF分別為0.647、0.980、0.853，RSD分別為1.20%、1.12%、1.23%，無顯著性影響（RSD＜3%）。

（3）不同儀器對RCF的影響：考察了不同高效液相色譜儀Acchorm S6000、Waters e2695、島津Nexera LC-40對RCF的影響。結(jié)果（表1）表明，不同高效液相色譜儀中，L-羥脯氨酸與甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的RCF分別為0.661、0.958、0.848，RSD分別為0.87%、1.43%、1.99%，無顯著性影響（RSD＜3%）。

（4）不同色譜柱對RCF的影響：考察了不同色譜柱Waters T-nature C18、Agilent Zorbax XDB C18、Welch ultimate AQ C18對RCF的影響。結(jié)果（表1）表明，不同色譜柱中，對L-羥脯氨酸與甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的RCF分別為0.654、0.954、0.857，RSD分別為1.29%、0.06%、0.70%，無顯著性影響（RSD＜3%）。

（5）RCF的確定：綜合以上對RCF影響因素的考察，對所得數(shù)據(jù)取平均值，最終確定L-羥脯氨酸與甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸間的RCF分別為0.651、0.958、0.857，RSD分別為1.20%、1.78%、1.09%。結(jié)果見表1。

表1 各成分的RCFTable 1 RCF of each component

（6）待測組分色譜峰的定位：當(dāng)僅使用L-羥脯氨酸作為對照品時(shí)，為了能夠準(zhǔn)確確認(rèn)甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸色譜峰的位置，利用相對保留值定位，即確認(rèn)內(nèi)參物的保留時(shí)間，加上相對保留值，再根據(jù)峰形判斷，辨別目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。

考察了采用不同儀器Acchorm S6000、Waters e2695、島津Nexera LC-40和不同色譜柱Waters Tnature C18、Agilent Zorbax XDB C18、Welch ultimate AQ C18時(shí)，L-羥脯氨酸色譜峰與甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸色譜峰的相對保留值（tis＝tRi/tRs，公式中ti/s為相對保留時(shí)間，tRi為待測成分對照品保留時(shí)間，tRs為內(nèi)參物保留時(shí)間）。對不同儀器與不同色譜柱所得數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果顯示，L-羥脯氨酸色譜峰與甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸色譜峰的tis為1.417、1.941、2.084，RSD分別為2.32%、3.26%、3.37%，均小于5%。表明采用相對保留值法對待測成分定位是合理的。

2.2.10 樣品測定及驗(yàn)證結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的QAMS法的準(zhǔn)確性，本研究采用外標(biāo)法（ESM）和QAMS法15批復(fù)方阿膠漿中L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量進(jìn)行測定。取15個(gè)批次（批號1907011、1907012、1907014、1907015、1907017、1907020、1907021、1907022、1909004、1909007、1909010、1909011、1909013、1909015、1909016，編號依次對應(yīng)為S1～S15）的復(fù)方阿膠漿，每個(gè)批次平行制備3份供試品溶液，依次進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。

表2 EMS法與QAMS法測定4種氨基酸的含量 (n = 3)Table 2 Contents of four amino acids by QAMS and EMS(n = 3)

同時(shí)采用t檢驗(yàn)、相對偏差法和Pearson相關(guān)系數(shù)法對兩種方法的含量測定結(jié)果進(jìn)行比較分析。經(jīng)t檢驗(yàn)比較，結(jié)果顯示常規(guī)的外標(biāo)法實(shí)測含量值與QAMS計(jì)算的含量無顯著性差異（P＜0.001）；相對偏差法計(jì)算結(jié)果顯示，外標(biāo)法實(shí)測含量值與QAMS計(jì)算的各成分含量相對偏差分別為1.88%、2.97%、0.74%；Pearson相關(guān)系數(shù)結(jié)果均為1，說明2種方法得到含量相似性極高。以上結(jié)果表明ESM法和QAMS法測定結(jié)果無顯著性差異。

3 討論

3.1 IMMS薄層色譜鑒別

3.1.1 對照物的選擇 復(fù)方阿膠漿的制備工藝是紅參、黨參、熟地黃、山楂水煎煮的提取方法。前期實(shí)驗(yàn)采用HPLC-Q-TOF-MSn技術(shù)研究表明復(fù)方阿膠漿化學(xué)成分組成復(fù)雜，包括人參皂苷類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類等多種結(jié)構(gòu)類型，且多為大極性化合物。

復(fù)方阿膠漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2020版）紅參僅采用對照品（人參三醇）對照的鑒別方法。但是人參三醇為皂苷元，化合物極性較小。人參皂苷Rg1具有良好的調(diào)控血管新生的作用[5-6]，且該化合物為紅參飲片薄層鑒別的對照品之一。因此，本研究中紅參的薄層色譜鑒別采用人參皂苷Rg1和紅參對照藥材的雙對照方法。

《中國藥典》2020年版中，復(fù)方阿膠漿山楂的鑒別方法是采用山楂對照藥材進(jìn)行對照?！吨袊幍洹肥珍浀纳介幉募昂猩介膹?fù)方制劑鑒別方法多用熊果酸作為對照品。復(fù)方阿膠漿化學(xué)成分組成研究中未發(fā)現(xiàn)熊果酸，這可能與其極性較小有關(guān)。牡荊素鼠李糖苷屬于黃酮二糖苷類化合物，主要分布于山楂葉和山楂中，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的血管活性物質(zhì)、改善心肌供血量等作用[7-8]。本研究采用山楂對照藥材和牡荊素鼠李糖苷對照品的雙對照方法。

3.1.2 供試品制備方法的優(yōu)化 《中國藥典》2020年版復(fù)方阿膠漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收錄熟地黃的薄層鑒別方法。含有熟地黃的口服液體制劑，多以熟地黃對照藥材為對照物，其供試品溶液制備方法多采用醋酸乙酯溶劑萃取富集。毛蕊花糖苷易溶于醋酸乙酯[9]。因此，本研究中熟地黃薄層色譜鑒別的供試品溶液制備采用甲醇沉淀蛋白后，醋酸乙酯萃取富集的方法。擬將山楂薄層色譜鑒別采用熟地黃相同供試品制備方法，但經(jīng)過多次嘗試，均不能滿足鑒別的專屬性要求。山楂的供試品溶液的制備方法采用復(fù)方阿膠漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2020版）鑒別項(xiàng)下山楂的薄層色譜鑒別的供試品制備方法。

《中國藥典》2020年版中收錄含有紅參的復(fù)方制劑在薄層色譜鑒別中供試品溶液的制備多采用水飽和正丁醇萃取皂苷類成分。結(jié)合參芪口服液、歸脾合劑等復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，黨參的薄層色譜鑒別的供試品溶液制備也使用水飽和正丁醇溶液萃取的方法[3]。再者，現(xiàn)有的供試品制備方法中，對皂苷類成分如人參皂苷、黃芪甲苷等多采用1%～2%氫氧化鈉溶液（pH 13.40）或濃氨試液（pH 11.12）多次洗滌正丁醇萃取液。文獻(xiàn)報(bào)道黨參炔苷在堿性溶液pH值大于12時(shí)，對其穩(wěn)定性影響較為顯著[10]，因此，以黨參炔苷為對照品時(shí)，供試品溶液的制備不宜用強(qiáng)堿性的氫氧化鈉溶液或濃氨試液（pH＞12）進(jìn)行處理。本研究對不同濃度的氫氧化鈉試液及氨試液進(jìn)行考察，最終確定使用水飽和正丁醇用量（20 mL）的1.5倍體積比的弱堿性氨試液（30 mL）洗滌1次。

3.1.3 展開方法 薄層同向多次展開技術(shù)是薄層展開一定展距后，取出晾干，再進(jìn)行展開。多次展開等于延長展開距離，從而提高了分離效果[11]。本研究黨參陰性樣品和黨參炔苷對照品在同一比移值（Rf）均存在斑點(diǎn)，無法滿足黨參鑒別的專屬性要求。將展開后的薄層板晾干后繼續(xù)在同一展開劑中展開，連續(xù)展開3次，有效區(qū)別了干擾斑點(diǎn)與鑒別斑點(diǎn)。該方法為其他中成藥的質(zhì)量控制的鑒別提供了借鑒。

3.2 QAMS含量測定

3.2.1 指標(biāo)成分的選擇 阿膠是復(fù)方阿膠漿中的君藥，占據(jù)重要的地位。復(fù)方阿膠漿現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)僅有總氮量一項(xiàng)，該質(zhì)控方法專屬性較差[12]。阿膠的化學(xué)成分主要為驢皮所含原膠原的降解物，包括明膠、蛋白質(zhì)及多種氨基酸。其中氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，也是生物代謝過程中的重要物質(zhì)[13]。L-羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸，其含量在膠原蛋白中比例基本固定[14]。甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸在阿膠中含量較高[15]?！吨袊幍洹?020年版阿膠藥材含量測定的指標(biāo)成分也是L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸。因此，選用這4個(gè)成分作為指標(biāo)成分的復(fù)方阿膠漿含量測定方法，其專屬性和有效性更好。再者可以有效地控制從單味藥（阿膠）到成方制劑（復(fù)方阿膠漿）的轉(zhuǎn)移和傳遞過程。

此外，將QAMS應(yīng)用于4種氨基酸的含量測定，可以改善檢測多種指標(biāo)成分檢測而造成的操作繁瑣、成本高、耗時(shí)長等現(xiàn)狀。建立一種測定單個(gè)有效成分實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定多個(gè)有效成分的快速測定方法，可以很大程度上克服對多指標(biāo)成分質(zhì)量控制的限制[16]。

3.2.2 測定方法的優(yōu)化 以《中國藥典》2020年版中阿膠藥材的測定方法為基礎(chǔ)，本研究對復(fù)方阿膠漿樣品的稀釋倍數(shù)、鹽酸的用量、水解時(shí)間和水解溫度進(jìn)行了考察，以確定復(fù)方阿膠漿樣品酸水解的實(shí)驗(yàn)條件。同時(shí)也考察了PITC的用量對衍生化的影響。研究發(fā)現(xiàn)0.5倍和1倍量PITC反應(yīng)后，氨基酸含量無明顯差異。考慮到PITC對色譜柱損害較大，因此，使用0.5倍量PITC試劑，并使用等體積的正己烷萃取除去衍生化試劑，避免色譜柱柱效降低[17]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突