基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)經(jīng)典名方竹茹湯中葛根的質(zhì)量標(biāo)志物（QMarker）預(yù)測(cè)分析

王 璐，張禮欣，賈奧蒙，毛春芹，李 林，侯金才，郭 勇，陸兔林*，申屠銀洪

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

2.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430

3.浙江桐君堂中藥飲片有限公司，浙江 桐廬 311500

竹茹湯（Zhuru Decoction，ZRD）出自宋朝許叔微的《普濟(jì)本事方》卷第四·翻胃嘔吐霍亂·竹茹湯，原方由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜、大棗6味藥組成，主治胃熱嘔吐，其后經(jīng)歷藥味組成、劑量和功效主治等方面的改變，還可用于治療酒嘔。方中重用葛根，清胃生津，是為君藥；半夏、竹茹、生姜和胃止嘔；甘草、大棗健脾益氣，調(diào)和諸藥[1-2]。

葛根Puerariae Lobatae Radix（PLR）來源于豆科葛屬植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根[3]，味甘、辛，涼，能解肌退熱、生津止渴、解酒毒。用于外感發(fā)熱頭痛、口渴、酒毒傷中。據(jù)報(bào)道[4]，葛根水提物能縮短小鼠醉后睡眠時(shí)間，加速酒精在肝臟中代謝速度，降低肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)，另有研究[5]證明葛根中黃酮和葛根素等成分可通過調(diào)節(jié)酒精和脂質(zhì)代謝減輕斑馬魚酒精性肝損傷。葛根除胃熱、解酒的作用與竹茹湯和胃止嘔、治療酒嘔的功效相一致，此外，葛根被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病和免疫系統(tǒng)疾病的臨床治療[6]。

為提升中藥及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)現(xiàn)有質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制方法及存在問題進(jìn)行研究分析后，劉昌孝院士[7]于2016年提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的概念，后經(jīng)張鐵軍等[8]總結(jié)歸納得出中藥質(zhì)量標(biāo)志物應(yīng)符合有效、特有、傳遞與溯源、可測(cè)和處方配伍的“五原則”，現(xiàn)如今預(yù)測(cè)中藥Q-Marker多遵循此五原則。

中藥及其復(fù)方制劑成分復(fù)雜，質(zhì)量難以控制，Q-Marker的建立有利于中藥全程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源，是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的指標(biāo)。中藥指紋圖譜能充分反應(yīng)中藥化學(xué)成分的傳遞和溯源，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則是近幾年興起的基于成分-靶點(diǎn)-通路-疾病科學(xué)地對(duì)中藥藥效進(jìn)行預(yù)測(cè)的一種手段，也能從理論上闡明中藥的有效性，指紋圖譜結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)適用于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。本課題組基于Q-Marker理論，通過指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，以“Q-Marker五原則”為核心，預(yù)測(cè)經(jīng)典名方竹茹湯中葛根的Q-Marker，以期為經(jīng)典名方中單味藥的Q-Marker研究提供借鑒，同時(shí)為全面控制經(jīng)典名方竹茹湯奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研制竹茹湯相關(guān)制劑及其質(zhì)量控制提供思路[9-12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD紫外檢測(cè)器，Chem Station色譜工作站，安捷倫科技有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA1104N電子天平，d＝0.1 mg，上海菁海儀器有限公司；MS-105D電子天平，d＝0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；ZYX0071超純水系統(tǒng)，南京漢隆實(shí)驗(yàn)器材有限公司；MGH21S011紅外爐，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品葛根素，批號(hào)110752-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品3′-羥基葛根素（批號(hào)180102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、3′-甲氧基葛根素（批號(hào)171204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批號(hào)171216，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；對(duì)照品大豆苷（批號(hào)20111016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、大豆苷元（批號(hào)YY20101110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司。甲醇，分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；乙腈，色譜純，默克股份兩合公司；甲酸，色譜純，美國(guó)恩科公司；水為娃哈哈純凈水。

竹茹湯由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜和大棗6味藥組成，均購(gòu)自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定。每味藥共收集多個(gè)產(chǎn)地，總批次不少于15批，均明確了各藥材基原、藥用部位、產(chǎn)地及其采收加工方法。本課題組前期已按照《中國(guó)藥典》2020年版項(xiàng)下各味藥的檢測(cè)方法和要求對(duì)藥材進(jìn)行檢測(cè)，合格的優(yōu)質(zhì)藥材按照《中國(guó)藥典》2020年版項(xiàng)下炮制方法及經(jīng)典名方申報(bào)資料要求擬定的飲片草案，將藥材炮制成合格飲片。

本實(shí)驗(yàn)共研究15批葛根藥材水煎液、15批葛根飲片水煎液以及15批不同批次飲片及3批同批次飲片制備的共18批竹茹湯，其中葛根來自陜西、安徽、河南3個(gè)產(chǎn)地共15批，為豆科葛屬植物野葛P.lobata(Willd.) Ohwi的干燥根；半夏來自江蘇泰州、甘肅天水、貴州3個(gè)產(chǎn)地共15批，為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖；甘草來自新疆阿勒泰、內(nèi)蒙鄂爾多斯、甘肅隴西3個(gè)產(chǎn)地共15批，為豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖；竹茹來自江西、四川2個(gè)產(chǎn)地共15批，為禾本科剛竹屬植物淡竹Phyllostachys nigra(Lodd.) Munro var.henonis(Mitf.) Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層；生姜來自山東、云南2個(gè)產(chǎn)地共15批，為姜科姜屬植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖；大棗來自山東新泰、河北滄州、山西聞喜3個(gè)產(chǎn)地共15批，為鼠李科棗屬植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實(shí)。藥材及對(duì)應(yīng)飲片來源與批號(hào)見表1。

表1 藥材及對(duì)應(yīng)飲片來源與批號(hào)Table 1 Source and batch number of medicinal materials and decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～4 min，0.5%～8%乙腈；4～25 min，8%～10%乙腈；25～36 min，10%乙腈；36～38 min，10%～14%乙腈；38～55 min，14%～16%乙腈；55～60 min，16%～23%乙腈；60～70 min，23%～30%乙腈；70～85 min，30%～75%乙腈；85～89 min，75%～100%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，加50%甲醇配制成含3′-羥基葛根素88.11 μg/mL、葛根素285.14 μg/mL、3′-甲氧基葛根素92.57 μg/mL、葛根芹菜糖苷114.97 μg/mL、大豆苷86.74 μg/mL、大豆苷元57.49 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

本課題組前期已對(duì)竹茹湯基準(zhǔn)樣品的制備方法、工藝參數(shù)進(jìn)行了考察，按照經(jīng)典名方申報(bào)資料要求隨機(jī)組合多批次，采用確定的煎煮方法得到15批葛根藥材水煎液（編號(hào)YC1～YC15）、15批葛根飲片水煎液（編號(hào)YP1～YP15）和18批竹茹湯（編號(hào)ZRD1～ZRD18）和1批缺葛根陰性水煎液（編號(hào)YX）。分別取上述液體30 mL于蒸發(fā)皿水浴揮干，50%甲醇復(fù)溶，定容至10 mL量瓶中，離心，過0.22 μm微孔濾膜即得。

2.4 葛根藥材、飲片水煎液及竹茹湯指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取ZRD供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋色譜圖。選擇保留時(shí)間穩(wěn)定、面積大的葛根素色譜峰作為參照峰，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.13%，相對(duì)峰面積RSD值均小于4.42%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取平行制備的ZRD供試品溶液6份，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄指紋色譜圖。以葛根素為參照峰，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.12%，相對(duì)峰面積RSD值均小于4.97%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取ZRD供試品溶液，分別室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄指紋色譜圖。以葛根素為參照峰，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.12%，相對(duì)峰面積RSD值均小于4.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 指紋圖譜的建立 將15批葛根藥材水煎液、15批葛根飲片水煎液及18批竹茹湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，將圖譜以AIA格式保存，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）。以S1圖譜作為參照譜，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，15批葛根藥材水煎液、葛根飲片水煎液均分別得到了21個(gè)共有峰，18批竹茹湯基準(zhǔn)樣品得到了25個(gè)共有峰，15批葛根藥材水煎液、葛根飲片水煎液以及18批竹茹湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜疊加圖分別見圖1～3。

圖1 15批葛根藥材水煎液指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of PLR decoction

2.4.5 相似度分析 將15批葛根藥材、飲片水煎液和18批竹茹湯的指紋圖譜均導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012年版），計(jì)算相似度，結(jié)果15批葛根藥材水煎液（編號(hào)YC1～YC15）的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000；15批葛根飲片水煎液（編號(hào)YP1～YP15）的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000；18批竹茹湯（編號(hào)ZRD1～ZRD18）的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999；可見，15批葛根藥材、15批葛根飲片水煎液和18批竹茹湯的指紋圖譜相似度均＞0.95，表明葛根藥材、飲片水煎液和竹茹湯的質(zhì)量穩(wěn)定均一。

圖2 15批葛根飲片水煎液指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 15 batches of PLR pieces decoction

圖3 18批竹茹湯指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of 18 batches of ZRD

2.4.6 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 根據(jù)指紋圖譜分析結(jié)果，將多批次葛根藥材水煎液、葛根飲片水煎液、竹茹湯指紋圖譜共有模式、缺葛根陰性水煎液和混合對(duì)照品的指紋圖譜進(jìn)行疊加。采用對(duì)照品比對(duì)的方式，指認(rèn)了葛根藥材、飲片水煎液及竹茹湯指紋圖譜共有模式中的6個(gè)共有峰，分別為3′-羥基葛根素（4號(hào)峰）、葛根素（6號(hào)峰）、3′-甲氧基葛根素（7號(hào)峰）、葛根芹菜糖苷（9號(hào)峰）、大豆苷（11號(hào)峰）、大豆苷元（23號(hào)峰），且這6個(gè)峰在竹茹湯中無陰性干擾，見圖4。

圖4 竹茹湯、葛根藥材、葛根飲片水煎液指紋圖譜共有模式圖和混合對(duì)照品、缺葛根陰性水煎液色譜圖Fig.4 Fingerprints of ZRD, PLR decoction, PLR pieces decoction and chromatograms of mixed control substance and negative decoction of PLR pieces

對(duì)15批葛根藥材水煎液、飲片水煎液指紋圖譜相似度計(jì)算，各產(chǎn)地葛根指紋圖譜相似度均大于0.95，說明不同產(chǎn)地間葛根藥材及飲片的整體化學(xué)組分類似，且與復(fù)方共有6個(gè)特征性成分，由此看出葛根中這6個(gè)成分實(shí)現(xiàn)了“藥材-飲片-復(fù)方”的傳遞，具有良好的傳遞與溯源性，且在配伍處方中也能得到較好的指認(rèn)，以此為基礎(chǔ)將篩選出的竹茹湯中葛根的6個(gè)活性成分進(jìn)一步進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，選取的這6個(gè)成分均在指紋圖譜中響應(yīng)值前10，且根據(jù)前期文獻(xiàn)研究推測(cè)可能與竹茹湯治療胃熱嘔吐、解酒嘔的功效關(guān)聯(lián)性更為密切。

2.5 基于成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），獲取3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6個(gè)化合物的靶點(diǎn)信息；通過PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）進(jìn)行搜索，將得到的化合物SMILES結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction服務(wù)器（http://new.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并結(jié)合TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)，得到上述6個(gè)化合物的作用靶點(diǎn)，篩去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到與其有關(guān)的作用靶點(diǎn)共159個(gè)。

2.5.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI能夠體現(xiàn)蛋白靶點(diǎn)彼此之間的相互作用，這些作用包括參與傳遞生物信號(hào)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、調(diào)控能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期等。對(duì)6個(gè)化合物的靶點(diǎn)相互作用進(jìn)行分析篩選，能夠辨識(shí)與竹茹湯功效關(guān)聯(lián)更加密切的成分，進(jìn)一步確證復(fù)方中葛根的Q-Marker。將篩選出的159個(gè)靶點(diǎn)，導(dǎo)入在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)軟件（https://string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數(shù)評(píng)分值為“high confidence＞0.9”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)設(shè)置不變，獲得核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），結(jié)果共獲得159個(gè)節(jié)點(diǎn)，421條邊。將PPI結(jié)果以TSV文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，并利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯?jì)算選取度值（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)且度值≥15的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。經(jīng)篩選得到14個(gè)核心靶點(diǎn)，結(jié)果見表2。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，這14個(gè)靶點(diǎn)9個(gè)與大豆苷元相關(guān)、7個(gè)與葛根素相關(guān)、3個(gè)與大豆苷相關(guān)。

表2 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Table 2 Topological properties of core targets network

圖5 作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network diagram of targets

2.5.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)14個(gè)潛在的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括基因產(chǎn)物細(xì)胞功能、分子功能和生物功能分析，對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類；KEGG通路富集分析可以得到竹茹湯中葛根核心靶點(diǎn)的信號(hào)通路。GO和KEGG分析均選取P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GO富集分析共獲取78個(gè)條目，其中生物過程（biological process，BP）占54個(gè)，分子功能（molecular function，MF）占20個(gè)，細(xì)胞組成（cellular component，CC）占4個(gè)，設(shè)置P＜0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，選取顯著性程度前20的條目進(jìn)行展示，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，以上靶點(diǎn)參與的生物過程包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正負(fù)調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、核染色質(zhì)、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合等分子功能，推測(cè)竹茹湯中葛根通過這些功能調(diào)控機(jī)體，解熱止嘔。

圖6 GO富集分析 (前20條)Fig.6 GO analysis of number of genes (top 20)

KEGG富集分析共得到75條通路，根據(jù)顯著性程度P＜0.01，篩選得到43條相關(guān)通路，其中排名前20的通路如圖7所示，主要包括乙型肝炎、癌癥通路、HIF-1信號(hào)通路、炎癥性腸病、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等。

圖7 KEGG富集分析Fig.7 Enrichment analysis results of KEGG

2.5.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)篩選得到的6個(gè)成分、159個(gè)靶點(diǎn)和20條關(guān)鍵通路，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖8。根據(jù)Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，以成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路的度值為參考，發(fā)現(xiàn)大豆苷元、葛根素、大豆苷的連接度相對(duì)較高，可能是竹茹湯中葛根發(fā)揮治療胃熱嘔吐、酒嘔功效的活性物質(zhì)；轉(zhuǎn)錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1）、TNF、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β（signal transducer and activator of transcription 1-α/β，STAT1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、STAT3、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）9個(gè)靶點(diǎn)的連接度較高（度值≥10），可能是竹茹湯中葛根發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；20條信號(hào)通路中除Pathways in cancer（度值＝11）、Hepatitis B（度值＝9）略高，NOD-like receptor signaling pathway（度值＝5）略低外，其余差異不大，因此，20條信號(hào)通路均可能是竹茹湯中葛根的關(guān)鍵信號(hào)通路。

圖8 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 “Compound-target-pathway” network diagram

2.6 整合分析

本研究通過建立葛根藥材、飲片水煎液和竹茹湯的指紋圖譜，指認(rèn)其共有峰，并對(duì)指認(rèn)出的成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，篩選得到竹茹湯中葛根的核心靶點(diǎn)和信號(hào)通路，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值分析得出結(jié)論：大豆苷元、葛根素、大豆苷3個(gè)成分可能是竹茹湯中葛根發(fā)揮治療胃熱嘔吐、酒嘔功效的活性成分。朱衛(wèi)豐等[13]基于Q-Marker的新概念從成分特有性、傳統(tǒng)功效、傳統(tǒng)藥性、成分可測(cè)性、中藥配伍環(huán)境（藥對(duì)配伍、復(fù)方配伍、經(jīng)典方配伍）、成分有效性等多個(gè)方面對(duì)單味藥葛根的Q-Marker進(jìn)行了深入全面的探討分析，大豆苷元、葛根素、大豆苷在傳統(tǒng)功效、成分可測(cè)性、成分有效性這3個(gè)方面均有顯著的Q-Marker特性。基于Q-Marker的五原則進(jìn)行分析，這3個(gè)成分在竹茹湯中從藥材-飲片-復(fù)方均能實(shí)現(xiàn)良好的傳遞與溯源，且在復(fù)方中無陰性干擾，為葛根所特有，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從理論上證明了其有效性，綜上結(jié)合指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)竹茹湯中葛根的Q-Marker進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，大豆苷元、葛根素、大豆苷這3個(gè)成分基本符合Q-Marker五原則，故預(yù)測(cè)其為竹茹湯中葛根潛在的Q-Marker。

3 討論

本研究依據(jù)劉昌孝院士[7]提出的Q-Marker理念，采用指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法分析預(yù)測(cè)竹茹湯中葛根發(fā)揮治療胃熱嘔吐功效的QMarker。通過建立葛根藥材、飲片水煎液和竹茹湯的指紋圖譜從傳遞和溯源性、可測(cè)性的角度對(duì)葛根進(jìn)行分析，指認(rèn)出3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6個(gè)成分，從Q-Marker特有性的角度進(jìn)行分析，這6個(gè)成分均是竹茹湯中葛根的特有成分，方中無其他藥味干擾。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從有效性的角度對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大豆苷元、葛根素、大豆苷3個(gè)活性成分通過調(diào)控RELA、AKT1、TNF、STAT1、IL-6、MAPK14、STAT3、JUN、TP53、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300（histone acetyltransferase p300，EP300）、表皮生長(zhǎng)因子受體 erbB1（epidermal growth factor receptor erbB1，EGFR）等關(guān)鍵靶點(diǎn)，作用于Interleukin-6、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體（NODlike receptor）信號(hào)通路、Toll樣受體（Toll-like receptor）信號(hào)通路等關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮竹茹湯治療胃熱嘔吐、酒嘔的功效。

葛根主要含有異黃酮類、三萜類、皂苷類和多糖類，含量最多的成分為異黃酮類物質(zhì)，主要包括大豆苷、大豆苷元與葛根素等，其中葛根素含量占比最大[14]。葛根素能夠顯著改善高脂誘導(dǎo)的糖尿病小鼠抑郁癥狀、對(duì)心血管、腦部、肝臟損傷均具有保護(hù)作用[15]，大豆苷作為中藥中天然的抗酒精成癮劑，有研究以此為線索改進(jìn)了編碼線粒體醛脫氫酶（ALDH2）的設(shè)計(jì)，而ALDH2非活性變異形式的ALDH2*2基因幾乎保護(hù)了該基因的所有載體免受酒精中毒的侵害[16]。大豆苷元是一種從植物中提取的次生代謝物，具有類黃酮結(jié)構(gòu)，以其對(duì)胃腸道疾病的保護(hù)作用而聞名，研究表明大豆苷元對(duì)動(dòng)物模型中食管反流引起的食道黏膜損傷具有預(yù)防作用[17]。

14個(gè)核心靶點(diǎn)中EGFR是一種跨膜糖蛋白，屬蛋白激酶家族的成員，具有誘導(dǎo)受體二聚和酪氨酸自磷酸化并導(dǎo)致細(xì)胞增殖。這個(gè)基因的突變與原發(fā)性乳腺癌發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]，有文獻(xiàn)報(bào)道EGFR可能在葛根解熱功效中發(fā)揮重要作用[19]。IL-6是一種有效的急性反應(yīng)誘導(dǎo)劑，在感染和組織損傷期間，IL-6的快速生成有助于宿主防御，TNF主要由巨噬細(xì)胞分泌，是引起發(fā)熱的有效熱原，在一定條件下可刺激細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞分化，最新研究發(fā)現(xiàn)，IL-6與TNF在眾多中藥抗酒精性胃損傷機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[20]。

由此可推測(cè)，竹茹湯中葛根的活性成分可能通過作用于這些蛋白靶點(diǎn)起到治療胃熱嘔吐、酒嘔的療效。葛根可能通過調(diào)控HIF-1信號(hào)等7條代謝通路起到解熱的作用[19]。高思佳等[21]研究發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等10條通路參與葛根解肌退熱，部分通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)，因此推測(cè)竹茹湯中葛根治療胃熱嘔吐的機(jī)制，可能是通過相關(guān)靶點(diǎn)作用于這些信號(hào)通路。

綜上所述，初步預(yù)測(cè)大豆苷元、葛根素、大豆苷為竹茹湯中葛根潛在的Q-Marker。竹茹湯具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，本研究采用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測(cè)竹茹湯中君藥葛根與復(fù)方功能主治密切相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、潛在藥理學(xué)機(jī)制及臨床拓展應(yīng)用提供參考依據(jù)。本研究基于中藥化學(xué)與中藥藥理學(xué)，整合多學(xué)科技術(shù)方法，基于可測(cè)性、可追溯性、有效性開展竹茹湯中葛根Q-Marker的系統(tǒng)辨識(shí)與確認(rèn)，為后期深入研究葛根及其相關(guān)復(fù)方的作用機(jī)制提供參考，有助于建立全程質(zhì)量控制體系，提高中藥產(chǎn)業(yè)質(zhì)量控制水平[22]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突