基于納米技術(shù)研究葶藶子炭治療急性肺損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制

趙玉升，李偉洋，曹天佑，陳玉民，白 雪，張 盈，吳 同，屈會(huì)化，趙 琰*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002

3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029

葶藶子系十字花科播娘蒿屬植物播娘蒿Descurainia sophia(L.) Webb.ex Prantl.或獨(dú)行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟種子。性辛、苦，大寒。歸肺、膀胱經(jīng)，具有瀉肺平喘、利水消腫之功效[1]。《傷寒雜病論》中更是將葶藶子用于治療肺癰、結(jié)胸、支飲等肺系疾病。

碳量子點(diǎn)是一類新興的以碳為骨架的納米材料，具有光穩(wěn)定性好、毒性小、生物相容性好、水分散性好等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。由于這些優(yōu)勢(shì)，碳量子點(diǎn)在生物成像[4]、藥物傳遞[5]、納米醫(yī)學(xué)[6]等多個(gè)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。值得注意的是，由于碳量子點(diǎn)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，其相關(guān)應(yīng)用開發(fā)為發(fā)現(xiàn)有效控制或治療某些疾病的新一代藥物提供了許多策略。碳量子點(diǎn)的相關(guān)生物活性如止血[7]、抗炎[8]、抗菌[9]和抗腫瘤[10]等已經(jīng)得到廣泛研究，引起了國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注，以期研究碳量子點(diǎn)的其他醫(yī)藥和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

本研究從納米材料學(xué)角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)葶藶子經(jīng)過高溫炮制后產(chǎn)生了一種新的物質(zhì)，將其命名為葶藶子炭納米類成分（Descurainiae Semen Carbonisatumnano-components，DSC-NCs），利用低分辨透射電鏡（TEM）、高分辨透射電鏡（HR-TEM）和X射線衍射儀（XRD）對(duì)DSC-NCs的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，進(jìn)一步利用HPLC排除小分子存在的干擾性，利用紫外光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）等方法來獲取DSC-NCs的化學(xué)基團(tuán)信息。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)該成分符合納米材料中碳量子點(diǎn)的基本特征，且有報(bào)道表明碳量子點(diǎn)治療急性肺損傷（acute lung injury，ALI）具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，本研究利用脂多糖誘導(dǎo)大鼠ALI，探究DSCNCs對(duì)ALI的保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制，以期為臨床治療ALI提供新的藥物和策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PXR-9馬弗爐，北京中科澳博科技股份有限公司；JEN-1230高分辨透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；F-4500熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；D8-Advanced X射線衍射儀，德國(guó)Bruker AXS公司；CECIL紫外分光光度計(jì)，英國(guó)Cambridge公司；Agilent 1260系列高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent Technologies公司；TecnaiG220透射電子顯微鏡（TEM），美國(guó)FEI公司；JEN-1230傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀和Escalab 250Xi X射線光電子能譜分析儀，美國(guó)Thermo公司。

1.2 藥品和試劑

葶藶子，產(chǎn)地河北，批號(hào)200723002，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)趙琰教授鑒定，為十字花科播娘蒿屬植物播娘蒿D.sophia(L.) Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子，采購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司；地塞米松，規(guī)格0.75 mg/片，批號(hào)H33020822，購(gòu)于浙江仙琚制藥股份有限公司；脂多糖與10%組織固定液購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）1000透析膜購(gòu)于北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒均購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛試劑盒等均購(gòu)買于南京建成生物工程研究所；乙醇和其他分析級(jí)化學(xué)試劑均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；雙蒸水與蒸餾水購(gòu)買于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，去離子水由北京中醫(yī)藥大學(xué)科研逸夫樓提供。

1.3 動(dòng)物和細(xì)胞

SPF級(jí)SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量（200.0±10.0）g，質(zhì)量合格證編號(hào)為110324201102996362。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)環(huán)境為北京中醫(yī)藥大學(xué)西校區(qū)動(dòng)物房屏障系統(tǒng)，保持室溫（24.0±1.0）℃，相對(duì)濕度55%～65%，12 h明暗交替，通風(fēng)良好，飼養(yǎng)期間內(nèi)自由進(jìn)水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前12 h小鼠禁食不禁水。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。人肺泡腺癌基底上皮A549細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

2 方法與結(jié)果

2.1 DSC-NCs的制備

稱取葶藶子干燥藥材480 g，放于坩堝中，鋁箔紙密封并加蓋于馬弗爐中燒制。馬弗爐程序升溫：第1階段5 min升溫至70 ℃，保溫25 min；第2階段25 min升溫至350 ℃，保溫1 h。將燒制好的葶藶子炭置于中藥粉碎機(jī)中粉碎。稱取炭粉末100 g，加入1800 mL去離子水中煎煮3次，溫度為100 ℃，時(shí)間為1 h。然后使用0.22 μm微孔濾膜將煎煮液進(jìn)行濾過，合并3次濾液，濃縮并選用Mw1000的透析膜透析7 d，烘干后獲取粉末20 mg，于4 ℃保存，留置待用。

2.2 HPLC分析

利用HPLC比較所獲得的DSC-NCs和葶藶子生藥在成分上的區(qū)別。稱取葶藶子生藥2 g，加入40 mL甲醇超聲處理30 min，獲得甲醇提取液。將上述制備的DSC-NCs用水稀釋至2 g/mL（按炭藥量計(jì)算），獲得DSC-NCs稀釋液。所有樣品使用0.22 μm微孔濾膜濾過后再進(jìn)樣。

色譜條件[11]：高效液相色譜儀采用四元泵-二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱為Reliasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為1%磷酸水溶液-乙腈，等度洗脫程序：0～12 min，10%乙腈；12～18 min，10%～14%乙腈；18～30 min，14%～19%乙腈；30～35 min，19%乙腈；35～40 min，19%～25%乙腈；40～50 min，25%乙腈；進(jìn)樣量10.0 μL；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為330 nm；柱溫30 ℃。

經(jīng)過高溫炭化、煎煮、濾過、濃縮、透析后獲得DSC-NCs溶液，利用HPLC比較350 ℃下制備的DSC-NCs溶液和葶藶子生藥乙醇提取液的成分差異。如圖1所示，葶藶子乙醇提取液中可以觀察到一系列峰，說明含有苷類化合物等小分子化合物。而與之形成鮮明對(duì)比的是，經(jīng)過透析后的DSC-NCs溶液中觀察不到小分子的存在，說明DSC-NCs溶液在經(jīng)過透析過程后的小分子成分已經(jīng)不存在了。經(jīng)過HPLC的觀察對(duì)比，在一定程度上排除了小分子化合物的干擾。

圖1 葶藶子 (a) 和DSC-NCs (b) 的HPLC圖Fig.1 HPLC profile of Descurainiae Semen (a) and DSCNCs (b)

2.3 DSC-NCs的表征

利用TEM、HR-TEM和XRD來獲取DSC-NCs的形貌大小、粒徑分布和晶格間距等微觀結(jié)構(gòu)信息；利用紫外光譜和熒光光譜來獲取DSC-NCs的光學(xué)特征信息；利用FTIR來獲取DSC-NCs表面的官能團(tuán)信息；利用XPS來分析DSC-NCs中所含有元素及其可能連接方式。

圖2-a為DSC-NCs低分辨電鏡表征結(jié)果，可以看出，DSC-NCs外觀形貌近球形，用Image J軟件對(duì)200個(gè)顆粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果為該納米類成分的粒徑分布在2.5～6.5 nm，符合正態(tài)分布。圖2-c為DSC-NCs的高分辨透射電鏡表征結(jié)果，DSC-NCs晶格分布明顯，晶格間距為0.224 nm。利用XRD進(jìn)一步分析DSC-NCs內(nèi)部原子在空間分布的狀態(tài)，從圖2-d中可以觀察到1個(gè)典型的非晶體衍射峰，這與自下而上法傾向于產(chǎn)生含無定形碳核的納米類成分有關(guān)[15]。

圖2 DSC-NCs的表征組圖Fig.2 Characterization of DSC-NCs

DSC-NCs的紫外光譜如圖2-e所示，DSC-NCs在260～280 nm處可以觀察到有一處微弱的吸收峰，這可能是由于含有雜原子的不飽和基團(tuán)引起的n-π*躍遷所導(dǎo)致[16]。DSC-NCs的熒光光譜分析結(jié)果如圖2-f所示，DSC-NCs的最大激發(fā)波長(zhǎng)為388 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為453 nm。

DSC-NCs紅外光譜結(jié)果如圖2-g所示，在3426、2922、1634、1034 cm-1處出現(xiàn)了特征峰，其中3426 cm-1的吸收峰提示可能存在-O-H鍵，2922 cm-1處的吸收峰提示為-CH2-的伸縮振動(dòng)峰，這是亞甲基的特征峰，1634 cm-1的強(qiáng)吸收峰為-C＝O鍵的伸縮振動(dòng)峰，1384 cm-1的強(qiáng)而尖銳的吸收峰提示可能為-OH的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，1034 cm-1處的吸收峰提示可能含有-C-O-C-鍵。這表明經(jīng)過炭化產(chǎn)生的DSC-NCs表面存在羥基、羧基和氨基等功能基團(tuán)[17]。

通過XPS對(duì)DSC-NCs的元素組成和基團(tuán)連接方式進(jìn)行了表征。具體測(cè)定結(jié)果如圖3所示，圖3-a中284.85、399.99、531.98 eV的位置有明顯的峰，表明DSC-NCs主要由C（72.84%）、O（22.3%）元素和少量的N（4.86%）元素共同組成，從圖中峰值可以看出，C和O的元素含量最多，高達(dá)95.14%。在DSC-NCs高分辨XPS圖譜中，圖3-b C1s譜帶中，顯示出284.71、285.77、288.23 eV 3個(gè)峰，與之相對(duì)應(yīng)的鍵分別是C-N、C＝O、C-O。在圖3-c的N1s譜帶中，顯示出399.62、400.32 eV 2個(gè)峰，與之相對(duì)應(yīng)的鍵分別是C-N、N-H。在圖3-d的O1s譜帶中，顯示出531.51、532.85 eV 2個(gè)峰，與之相對(duì)應(yīng)的鍵分別是C-O、C＝O[18]。

圖3 利用XPS分析技術(shù)對(duì)DSC-NCs的表面基團(tuán)和元素組成信息進(jìn)行分析Fig.3 Surface composition and elemental analysis of DSC-NCs by XPS

從以上圖譜特征數(shù)據(jù)的結(jié)果來看，分析解讀了DSC-NCs的主要元素組成和含量，得知其配位情況，證實(shí)了DSC-NCs除了C、O元素外，還被N與其他元素少量摻雜，并且推測(cè)有多種官能集團(tuán)共同存在于DSC-NCs的表面。

2.4 熒光量子產(chǎn)率（fluorescence quantum yield，F(xiàn)QY）測(cè)定

FQY也稱熒光量子效率，它是表示一種物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)[12]。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的結(jié)果為DSCNCs的相對(duì)FQY，參比物質(zhì)選擇硫酸奎寧。熒光光譜掃描時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度皆為10 nm。根據(jù)公式FQYNCs＝FQYRINCsARηNCs2/(IRANCsηR2)對(duì)DSC-NCs的FQY進(jìn)行計(jì)算，公式中I為發(fā)射光譜下的峰面積，A為365 nm時(shí)的吸光度值，η為溶劑的折射率，下標(biāo)NCs和R代表DSC-NCs和參照物。為了使重吸收效應(yīng)最小化，AR和ANCs的吸光度值應(yīng)該保證在0.05以下[13]。以硫酸奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行DSC-NCs的熒光量子產(chǎn)率測(cè)，最終計(jì)算得出DSC-NCs的熒光量子產(chǎn)率為17.31%。

2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 安全性是其生物應(yīng)用過程中需要考慮的問題之一，本實(shí)驗(yàn)以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)DSC-NCs對(duì)A549細(xì)胞的毒性大小[14]。將培養(yǎng)好的A549細(xì)胞懸液稀釋至1×105個(gè)/mL，置于96孔板上。在四周邊緣緩慢加入PBS緩沖液（100 μL/mL），將其放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，條件設(shè)置為5% CO2、37 ℃，時(shí)間為24 h。之后棄去上清液，在對(duì)照組加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基，在給藥組依次加入已配制好的8種不同質(zhì)量濃度（1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81 μg/mL）的DSC-NCs溶液，每孔100 μL，再次放入CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。取出上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入CCK-8試劑（10μL/孔），繼而放入CO2培養(yǎng)箱，4 h后取出。將其放于酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)450 nm，記錄吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(Ae－Ab)/(Ac－Ab)

Ae為給藥組的吸光度，Ac為對(duì)照組吸光度，Ab為空白組吸光度

2.5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析。單因素 ANOVA分析方法用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，同時(shí)方差齊。組間差異則運(yùn)用LSD方法統(tǒng)計(jì)。

2.5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果如表1所示，當(dāng)DSC-NCs的質(zhì)量濃度為500.00 μg/mL和7.81 μg/mL時(shí)，其細(xì)胞存活率和對(duì)照組近似。當(dāng)DSC-NCs的質(zhì)量濃度大于500.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降低，說明DSCNCs在給藥質(zhì)量濃度高于500.00 μg/mL對(duì)A549細(xì)胞存在一定的毒性。當(dāng)DSC-NCs的質(zhì)量濃度在7.81～500.00 μg/mL，對(duì)A549細(xì)胞具有一定的促進(jìn)增殖作用，而質(zhì)量濃度在7.81～125.00 μg/mL，隨著DSC-NCs質(zhì)量濃度的升高，增殖作用逐漸增強(qiáng)，質(zhì)量濃度在125.00 μg/mL時(shí)，增殖作用達(dá)到最強(qiáng)，其后在125.00～500.00 μg/mL，隨著質(zhì)量濃度的升高，增殖作用反而逐漸降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后DSC-NCs在臨床上的應(yīng)用劑量提供了一定的參考。

表1 不同質(zhì)量濃度的DSC-NCs對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響 ( , n = 6)Table 1 Effect of different concentrations of DSC-NCs on viability of A549 cells ( , n = 6)

表1 不同質(zhì)量濃度的DSC-NCs對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響 ( , n = 6)Table 1 Effect of different concentrations of DSC-NCs on viability of A549 cells ( , n = 6)

組別 劑量/(μg·mL-1) 細(xì)胞存活率/%對(duì)照 - 100.00±10.37 DSC-NCs 1 000.00 53.97±3.29 500.00 103.57±7.21 250.00 130.95±11.14 125.00 144.58±7.58 62.50 133.99±11.85 31.25 112.64±7.20 15.63 118.39±9.50 7.81 100.33±7.34

2.6 DSC-NCs對(duì)脂多糖致大鼠ALI的作用研究

2.6.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥和造模 將48只SD大鼠，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（地塞米松，5 mg/kg）和DSC-NCs高劑量組（3.33 mg/kg）、中劑量組（1.67 mg/kg）、低劑量組（0.84 mg/kg）。適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后，DSC-NCs高、中、低劑量組連續(xù)10 d ip給藥，其他組均ip相同體積的生理鹽水。陽性對(duì)照組在造模前1 h ip地塞米松溶液，1 h后，除對(duì)照組ip等體積生理鹽水外，其余各組均ip制備的脂多糖溶液（5 mg/kg）進(jìn)行造模。

2.6.2 病理切片觀察 造模8 h后，用4%水合氯醛（0.40 g/kg）麻醉大鼠后進(jìn)行解剖，將大鼠左肺組織取出置于10%組織固定液中固定48 h以上，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅（H&E）染色。比較對(duì)照組，模型組，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組肺部的形態(tài)學(xué)變化。各組肺組織的病理形態(tài)結(jié)果如圖4所示，圖4-a顯示對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡的形態(tài)完整，肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與對(duì)照組比較，模型組的肺組織結(jié)構(gòu)破壞較為嚴(yán)重，明顯可見肺泡壁增厚、肺間質(zhì)充血，肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4-b）；與模型組比較，地塞米松組中肺泡形態(tài)較為完整，肺泡腔及肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)較模型組明顯減輕（圖4-c）；與模型組比較，給予不同劑量的DSC-NCs治療后，肺組織破壞程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血程度得到有效的緩解和不同程度的改善（圖4-d～f），其中高劑量組的效果最為明顯，具有一定的量效關(guān)系。

圖4 DSC-NCs對(duì)LPS致大鼠ALI肺組織病理改變的影響 (×50)Fig.4 Effect of DSC-NCs on pathological changes of lung tissue in rats with ALI induced by LPS (× 50)

2.6.3 血清中細(xì)胞因子水平 造模8 h后，用4%水合氯醛（0.40 g/kg）麻醉大鼠。使用采血針和真空采血管，經(jīng)腹主動(dòng)脈采集大鼠血液。將采集好的大鼠血液置于室溫環(huán)境下，靜置60 min，然后放入高速冰凍離心機(jī)中以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，獲取上清液，于-80 ℃保存，留置待用。按照試劑盒的指導(dǎo)說明進(jìn)行操作，分別測(cè)定血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。IL-6、IL-1β和TNF-α是急性炎癥的重要炎癥因子，各組大鼠血清中IL-1β的含量比較如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組血清中IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比較，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組均可以明顯降低大鼠血清中IL-1β的水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中DSC-NCs高劑量組低于地塞米松組，說明DSC-NCs高劑量組的治療作用較強(qiáng)于陽性藥。而隨著DSC-NCs的劑量降低，血清中IL-1β水平升高，存在明顯量效差異。DSC-NCs對(duì)大鼠血清中IL-6的含量與IL-1β類似，與對(duì)照組相比，模型組血清中IL-6水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低血清中IL-6水平（P＜0.01），其中以地塞米松組和DSC-NCs高劑量組的治療效果較優(yōu)。

表2 DSC-NCs對(duì)LPS致大鼠ALI血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響 ( , n = 8)Table 2 Effect of DSC-NCs on IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats with acute lung injury induced by LPS (,n = 8)

表2 DSC-NCs對(duì)LPS致大鼠ALI血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響 ( , n = 8)Table 2 Effect of DSC-NCs on IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats with acute lung injury induced by LPS (,n = 8)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(mg·kg-1)IL-1β/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)TNF-α/(pg·mL-1)對(duì)照 - 4.35±0.58 2.94±0.62 23.17±1.31模型 5 21.07±2.26## 20.29±1.27## 66.61±8.26##地塞米松 5 9.49±0.86** 6.30±1.06** 27.39±2.70**DSC-NCs 3.33 8.98±1.31** 8.75±1.15** 28.14±5.17**1.67 11.57±1.21** 13.98±1.36** 29.24±4.57**0.84 16.81±0.53** 14.47±1.26** 29.39±5.85**

各組大鼠血清中TNF-α的含量比較如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組血清中TNF-α水平明顯升高，具有顯著的差異性（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低大鼠血清TNF-α水平（P＜0.01），4者之間的差異并不明顯。

綜上所述，DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，表明DSC-NCs能夠抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌，而起到減輕肺損傷的作用。

2.6.4 抗氧化水平 取出小鼠的右肺，用濾紙將分離出的肺組織水分吸干，取一部分后使用電子天平進(jìn)行精確稱定，將稱好的肺組織放入10 mL EP管中，按照質(zhì)量體積比為1∶9加入生理鹽水制備成10%的組織勻漿，然后加入研磨球，使用冷凍混合球磨儀進(jìn)行研磨，最后使用高速冷凍離心機(jī)（3000 r/min，10 min）進(jìn)行離心，獲取肺組織勻漿上清液，按照試劑盒的說明，測(cè)定SOD活性和丙二醛的水平。

氧化應(yīng)激是ALI炎癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，通過進(jìn)一步評(píng)估SOD活性和丙二醛的水平來表征氧化還原狀態(tài)的變化。各組肺組織中SOD活性比較如表3所示，與對(duì)照組相比，模型組中SOD的活性明顯降低（P＜0.01），說明脂多糖誘導(dǎo)的ALI大鼠的肺組織發(fā)生了嚴(yán)重的氧化損傷。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高劑量組均能明顯升高肺組織中SOD的活性（P＜0.01），明顯提高了機(jī)體的抗氧化能力，DSC-NCs中劑量組也能提高肺組織中SOD的活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而DSC-NCs低劑量組與模型組比較沒有明顯差異。

各組肺組織中的丙二醛水平比較如表3所示，與對(duì)照組相比，模型組肺組織中丙二醛含量明顯升高，說明肺組織受損嚴(yán)重。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組肺組織中丙二醛的含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DSC-NCs能夠通過提高抗氧化能力和降低氧自由基的產(chǎn)生來減輕過度氧化應(yīng)激對(duì)肺臟的損傷作用。

表3 DSC-NCs對(duì)LPS致大鼠ALI肺組織中SOD活性和MDA水平的影響 ( , n = 8)Table 3 Effect of DSC-NCs on SOD activity and level of MDA in lung tissue of rats with ALI induced by LPS ( ,n = 8)

表3 DSC-NCs對(duì)LPS致大鼠ALI肺組織中SOD活性和MDA水平的影響 ( , n = 8)Table 3 Effect of DSC-NCs on SOD activity and level of MDA in lung tissue of rats with ALI induced by LPS ( ,n = 8)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(mg·kg-1) SOD/(U·mg-1) MDA/(nmol·mg-1)對(duì)照 - 149.33±18.32 3.83±0.14模型 5 71.98±9.15## 6.39±0.12##地塞米松 5 139.33±11.61** 4.59±0.27**DSC-NCs 3.33 128.83±9.37** 4.81±0.75**1.67 95.21±11.72* 4.95±0.61**0.84 85.16±29.71 5.17±0.63**

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過一系列成熟的制備工藝來獲取葶藶子炭化物純化后的透析液，經(jīng)TEM、HR-TEM、熒光光譜、FTIR、XPS等儀器鑒定并命名為DSC-NCs。DSC-NCs外觀形貌近球形，分散度良好，粒徑大小均一，主要集中在2.5～6.5 nm，晶格間距為0.224 nm。XPS分析顯示DSC-NCs中含有C、O、N等元素，其中C、O元素占主導(dǎo)地位，結(jié)合紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)葶藶子炭納米類成分表面官能團(tuán)豐富，含有大量的羥基、羧基等基團(tuán)。

經(jīng)過HPLC的觀察對(duì)比，經(jīng)過透析后的DSCNCs溶液中觀察不到小分子的存在，在一定程度上排除了小分子化合物的干擾。此外，本實(shí)驗(yàn)利用CCK-8法測(cè)定了DSC-NCs的安全性范圍在500 μg/mL以內(nèi)，生物安全性高。

ALI是一系列炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷，涉及多種炎癥介質(zhì)和效應(yīng)細(xì)胞，其發(fā)病原因多樣，其中由脂多糖引起的占大多數(shù)，可引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激導(dǎo)致肺損傷，是用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)ALI作用的經(jīng)典模型[19]。從本實(shí)驗(yàn)的肺組織切片來看，模型大鼠在給予不同劑量的DSC-NCs治療后，肺組織破壞程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)得到有效的緩解和不同程度的改善，說明DSC-NCs具有治療ALI的作用。

在ALI的形成過程中涉及到多方面的作用結(jié)果，單核-巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在受到外界刺激后聚集到肺泡腔，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，傳遞炎癥信號(hào)，通過級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)促進(jìn)炎癥的發(fā)展，導(dǎo)致肺部損傷[20]。TNF-α是最早參與ALI發(fā)病過程的炎癥因子，主要是由LPS刺激肺泡-巨噬細(xì)胞后生成，除了直接破壞內(nèi)皮細(xì)胞，還能刺激鄰近細(xì)胞釋放更多的炎癥因子，進(jìn)而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的招募[21]。此外，TNF-α還能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增加血管通透性以及影響肺水腫的形成，導(dǎo)致低氧血癥，從而進(jìn)一步加重肺損傷。IL-1β是固有免疫和炎性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞迅速聚集到肺部，引起炎癥介質(zhì)釋放，加重炎癥損傷，因此IL-1β的表達(dá)水平也是反映ALI嚴(yán)重程度的經(jīng)典指標(biāo)[22]。IL-6主要來源于單核-巨噬細(xì)胞，其能促進(jìn)炎癥發(fā)展，影響巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，大量的IL-6還會(huì)促進(jìn)血管活性物質(zhì)和中性粒細(xì)胞的釋放，脂多糖作用于機(jī)體后，能夠檢測(cè)到IL-6的水平有所升高，是檢測(cè)ALI的指標(biāo)之一[23]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，表明DSC- NCs能夠在一定程度上抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而起到減輕肺損傷的作用。

大量研究[24]表明，氧化應(yīng)激損傷是ALI發(fā)病的重要機(jī)制，能夠使細(xì)胞內(nèi)活性氧顯著增加，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，就會(huì)不斷大量形成新的自由基，造成肺組織損傷。SOD是一種重要的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡起重要作用，其活性高低反映了機(jī)體抗氧化能力的大小[25]。過量的活性氧會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生丙二醛，因而能夠作為反映脂質(zhì)過氧化嚴(yán)重程度的標(biāo)志物[26]。相關(guān)研究[27]表明葶藶子生藥能有效改善ALI引起的肺淤血、肺水腫以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度，其機(jī)制可能與發(fā)揮藥效的小分子物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)水通道蛋白5的含量有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)證明了從葶藶子炭中提取分離的DSC-NCs也能有效緩解ALI大鼠肺泡腔及肺間質(zhì)中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，改善肺水腫，尤其以高劑量組的作用更顯著，其機(jī)制可能與升高SOD的活性、減少丙二醛的含量有關(guān)，能夠通過提高抗氧化能力和降低氧自由基的產(chǎn)生來減輕過度氧化應(yīng)激對(duì)肺臟的損傷作用。但本實(shí)驗(yàn)尚未從相關(guān)信號(hào)通路的水平上去研究DSC-NCs發(fā)揮藥效的內(nèi)在機(jī)制，仍是今后重點(diǎn)研究的方向之一。因此，本實(shí)驗(yàn)中DSC-NCs的發(fā)現(xiàn)及其治療脂多糖致ALI的證明，不僅為葶藶子炭的活性成分提供了一個(gè)新的研究方向，也為DSC-NCs作為一種治療ALI的新型藥物研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)利用高溫?zé)峤夥ǔ晒妮闼炞犹恐刑崛》蛛x出新型納米類成分DSC-NCs。在脂多糖致大鼠ALI模型中，表面攜帶豐富基團(tuán)的DSC-NCs起到了明顯的保護(hù)作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制初步證明是與減少IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平有關(guān)，也可以在一定程度上減少肺部的炎癥，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化活性。本研究為DSC-NCs在臨床抗肺炎中的應(yīng)用提供了重要依據(jù)，為DSC-NCs的研發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突