高效液相色譜法測(cè)定CBZ-伐昔洛韋對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)

趙 婕，杜 勝，張 達(dá)

(宜昌天仁藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 宜昌 443000)

鹽酸伐昔洛韋是阿昔洛韋的前體藥物，口服后吸收迅速并在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化為阿昔洛韋，其抗病毒作用為阿昔洛韋所發(fā)揮，用于治療I型和II型單純性抱疹及帶狀抱疹。目前鹽酸伐昔洛韋已經(jīng)取代阿昔洛韋成為治療帶狀皰疹、生殖器皰疹的一線藥物[1]。

由于鹽酸伐昔洛韋的日用劑量比較大，所以對(duì)鹽酸伐昔洛韋原料藥中雜質(zhì)含量的要求非常嚴(yán)格。N-芐氧羰基-L-纈氨酸 2-[(2-氨基-1,6-二氫-6-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]乙基酯(CBZ-伐昔洛韋)是鹽酸伐昔洛韋的關(guān)鍵中間體，經(jīng)過(guò)氫化反應(yīng)得到伐昔洛韋，再成鹽即得到鹽酸伐昔洛韋[2]。CBZ-伐昔洛韋的純度對(duì)最終產(chǎn)品純度的影響非常大，因此制備高純度的CBZ伐昔洛韋是制備高純度鹽酸伐昔洛韋的前提條件。

CBZ-伐昔洛韋(Cbz-Valaciclovir)又叫N-芐氧羰基-L-纈氨酸 2-[(2-氨基-1,6-二氫-6-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]乙基酯，是一種由Cbz保護(hù)的纈氨酸，廣泛應(yīng)用于藥物合成領(lǐng)域。CBZ-伐昔洛韋用于生化試劑，萬(wàn)乃洛韋或伐昔洛韋等洛韋系列側(cè)鏈合成，增壓素等其它多肽合成。目前，《中國(guó)藥典》2020年版二部中對(duì)鹽酸伐昔洛韋的光學(xué)純度僅進(jìn)行比旋度檢測(cè)來(lái)監(jiān)控[3]，但美國(guó)藥典和歐洲藥典對(duì)鹽酸伐昔洛韋原料藥中異構(gòu)體雜質(zhì)D-伐昔洛韋均有明確的限度要求[4-5]。經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，異構(gòu)體雜質(zhì)D-伐昔洛韋主要產(chǎn)生于偶合工序堿催化縮合反應(yīng)的羧基活化的過(guò)程中，影響異構(gòu)體產(chǎn)生的主要因素是羧基活化時(shí)的溫度和時(shí)間[2]。因此，CBZ-伐昔洛韋作為鹽酸伐昔洛韋縮合反應(yīng)后的重要中間體，若該中間體中CBZ-D-伐昔洛韋雜質(zhì)不合格必然導(dǎo)致最終產(chǎn)品鹽酸伐昔洛韋中異構(gòu)體雜質(zhì)D-伐昔洛韋不合格，故非常有必要建立CBZ-伐昔洛韋中異構(gòu)體雜質(zhì)CBZ-D-伐昔洛韋雜質(zhì)的檢測(cè)方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試藥

e2695液相色譜儀,Waters；XSE 205電子分析天平,梅特勒-托利多。

CBZ-伐昔洛韋樣品(批號(hào)：YF01-191208)。甲醇(色譜級(jí))、乙腈(色譜級(jí))、高氯酸鈉(AR級(jí))、CBZ-伐昔洛韋對(duì)照品(EP雜質(zhì)E)、CBZ-D-纈氨酸對(duì)照品(18-07-1321奧遜生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件[6]

色譜柱以CHIRALCEL-OD-RH-CH(4.6 mm×150 mm，5 μm)為固定相；

流動(dòng)相A：取2.45 g高氯酸鈉，用水稀釋至1000 mL(高氯酸調(diào)節(jié)pH至2.5)；流動(dòng)相B：90%乙腈；流動(dòng)相A：流動(dòng)相B=70:30；

檢測(cè)波長(zhǎng)：251 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

對(duì)映異構(gòu)體不得過(guò)3.0%。

1.2.2 溶液制備

對(duì)映異構(gòu)體儲(chǔ)備液：精密稱定對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

CBZ-伐昔洛韋儲(chǔ)備液：精密稱定CBZ-伐昔洛韋對(duì)照品5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取CBZ-伐昔洛韋樣品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取CBZ-伐昔洛韋儲(chǔ)備液1 mL和對(duì)映異構(gòu)體儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 系統(tǒng)適用性

取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。對(duì)映異構(gòu)體與CBZ-伐昔洛韋的分離度最小值為3.7；CBZ-伐昔洛韋峰面積RSD為0.91%，對(duì)映異構(gòu)體峰面積RSD為0.89%。對(duì)映異構(gòu)體與CBZ-伐昔洛韋的分離度均>1.5，CBZ-伐昔洛韋與各色譜峰峰面積的RSD均<5.0%。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

取空白溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液、CBZ-伐昔洛韋儲(chǔ)備液、對(duì)映異構(gòu)體儲(chǔ)備液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

空白溶劑峰不干擾雜質(zhì)峰，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度R=3.7>1.5，能有效分離。

圖1表明CBZ-伐昔洛韋和其異構(gòu)體CBZ-D-伐昔洛韋能得到較好的分離，CBZ-伐昔洛韋保留時(shí)間約7.1 min，CBZ-D-伐昔洛韋保留時(shí)間約9.2 min，二者分離度大于1.5。

圖1 CBZ-伐昔洛韋異構(gòu)體檢測(cè)方法專屬性圖譜Fig.1 Specific map of CBZ-valaciclovir isomer detection method

2.2 精密度

供試品溶液：分別6次稱取CBZ-伐昔洛韋樣品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

取系統(tǒng)適用性溶液、6次的供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算6份供試品溶液中對(duì)映異構(gòu)體含量的RSD。對(duì)映異構(gòu)體含量的RSD為0.3%，RSD≤10%(n=6)。圖2表明該CBZ-伐昔洛韋樣品中所含異構(gòu)體雜質(zhì)為1.2%。

圖2 CBZ-伐昔洛韋樣品的代表性圖譜Fig.2 Representative profiles of CBZ-valaciclovir samples

2.2.1 定量限

樣品的制備：對(duì)專屬性項(xiàng)下各儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，至信噪比S/N≥10時(shí)的溶液濃度即為定量限濃度。

測(cè)定：重復(fù)進(jìn)樣6針，計(jì)算峰面積的RSD。測(cè)定結(jié)果如下表：

表1 定量限項(xiàng)下對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of the results of enantiomer determination under the limit of quantification

對(duì)映異構(gòu)體信噪比S/N最大值為13.6，最小值為10.7，峰面積的RSD為3.9%(n=6)。信噪比S/N均≥10，峰面積RSD≤10%(n=6)。對(duì)映異構(gòu)體定量限濃度為0.06 μg/mL，約相當(dāng)于樣品濃度0.012%。

2.2.2 檢測(cè)限

樣品的制備：對(duì)專屬性項(xiàng)下各儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，至信噪比S/N≥3時(shí)的溶液濃度即為檢測(cè)限濃度。

測(cè)定：重復(fù)進(jìn)樣3針。測(cè)定結(jié)果如表2。

表2 檢測(cè)限項(xiàng)下對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of enantiomer determination results under the detection limit

對(duì)映異構(gòu)體信噪比S/N最大值為4.4，最小值為3.8；信噪比S/N均≥3。對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)限濃度為0.02 μg/mL，約相當(dāng)于樣品濃度0.004%。

2.2.3 溶液穩(wěn)定性

樣品的制備：取專屬性項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液于室溫下放置24 h。

測(cè)定：分別于0 h、2 h、4 h、8 h、24 h進(jìn)樣，計(jì)算系統(tǒng)適用性中各組分峰面積和供試品中對(duì)映異構(gòu)體含量的RSD。測(cè)定結(jié)果如下表：

系統(tǒng)適用性溶液在室溫條件下放置24 h，CBZ-伐昔洛韋峰面積的RSD為0.51%，對(duì)映異構(gòu)體峰面積的RSD為0.42%。

供試品溶液在室溫條件下放置24 h，對(duì)映異構(gòu)體含量RSD為0.46%。

表3 溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical table of solution stability measurement results

供試品中對(duì)映異構(gòu)體含量的RSD≤15%，系統(tǒng)適用性中各組分峰面積RSD≤5.0%，故系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液于室溫下放置24 h溶液穩(wěn)定。

2.2.4 耐用性

按照專屬性項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣一針，按耐用性參數(shù)變化表考察：

表4 耐用性參數(shù)變化表Table 4 durability parameter variation table

各條件下系統(tǒng)適用性溶液中，主峰與對(duì)映異構(gòu)體分離度不小于1.5。

對(duì)柱溫和流速進(jìn)行調(diào)整后，主峰與相鄰雜質(zhì)峰及各已知雜質(zhì)峰之間分離度最小值為3.2，故不同柱溫和流速對(duì)CBZ-伐昔洛韋中對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)影響較小，分析方法耐用性較好。

3 結(jié) 論

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證[7-8]，該方法對(duì)CBZ-伐昔洛韋中異構(gòu)體雜質(zhì)CBZ-D-伐昔洛韋雜質(zhì)專屬性確認(rèn)分離度大于1.5，對(duì)CBZ-D-伐昔洛韋雜質(zhì)的檢測(cè)限為0.004%，在本實(shí)驗(yàn)中建立的高效液相色譜法，成功分離了CBZ-伐昔洛韋中的異構(gòu)體。

綜上所述，本文所建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、有效，能夠滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要，適用于CBZ-伐昔洛韋中異構(gòu)體雜質(zhì)CBZ-D-伐昔洛韋雜質(zhì)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果可靠。原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有建立異構(gòu)體檢測(cè)方法，現(xiàn)采用HPLC方法，提高了產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于保證產(chǎn)品安全有效。該液相方法的建立為今后的生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)異構(gòu)體雜質(zhì)的控制提供了有效的監(jiān)控手段。