茜素絡(luò)合物在青魚(yú)幼魚(yú)耳石上的標(biāo)記效果評(píng)價(jià)

朱亞華，姜 濤，陳修報(bào)，劉洪波，楊 健,

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081）

魚(yú)類標(biāo)記在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類的洄游、擴(kuò)散等生態(tài)學(xué)研究[1]，增殖放流成效評(píng)價(jià)[2]，漁業(yè)資源狀況評(píng)估[3-4]以及漁業(yè)管理措施的制定[5]等諸多方面具有重要的意義。與遺傳學(xué)標(biāo)記方法[6]相比，基于魚(yú)體化學(xué)物質(zhì)浸泡而使其耳石產(chǎn)生標(biāo)記的方法具有成本低、易應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)[6-9]。在魚(yú)類的全生活史過(guò)程中，作為主要起平衡和聽(tīng)覺(jué)功能的鈣化組織，耳石的結(jié)構(gòu)和組成均非常穩(wěn)定，不受代謝影響[10]，故不僅被用于資源群識(shí)別[11]、生境履歷重建和破譯魚(yú)齡及生活史過(guò)程[12-13]，也常被用作對(duì)魚(yú)類進(jìn)行特定化學(xué)標(biāo)記的載體[7-9]。比如熒光化學(xué)物質(zhì)會(huì)通過(guò)魚(yú)體結(jié)合于耳石中，相應(yīng)結(jié)合區(qū)在特定激發(fā)光下發(fā)出熒光[9]，從而起到標(biāo)記魚(yú)的效果；且標(biāo)記時(shí)間較長(zhǎng)，魚(yú)的死亡率較低[14-15]。茜素絡(luò)合物 (ALC) 就是其中廣受關(guān)注的一類[16-18]。

增殖放流一直是增殖漁業(yè)中的重要措施之一。開(kāi)展增殖放流活動(dòng)業(yè)已成為恢復(fù)野生魚(yú)類自然資源和促進(jìn)漁民增收的重要手段[19-20]。為此，研發(fā)可支撐經(jīng)濟(jì)魚(yú)類增殖放流效果評(píng)價(jià)的標(biāo)記方法意義重大。青魚(yú) (Mylopharyngodon piceus) 是我國(guó)著名的“四大家魚(yú)”之一，廣布于我國(guó)的長(zhǎng)江流域、附屬支流及各地湖泊[16]，為淡水漁業(yè)資源主要增殖放流的經(jīng)濟(jì)物種 (廣布種)。迄今，除王豐等[21]通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記方法對(duì)人工飼養(yǎng)的青魚(yú)和野生青魚(yú)進(jìn)行過(guò)初步鑒別外，尚未見(jiàn)其耳石標(biāo)記方面的報(bào)道。本研究首次用茜素絡(luò)合物對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行了浸泡標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記條件和效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為青魚(yú)探索一種合理有效的耳石化學(xué)標(biāo)記方法，并為今后淡水魚(yú)類相關(guān)的增殖放流效果評(píng)估提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉基地開(kāi)展。實(shí)驗(yàn)中所需青魚(yú)幼魚(yú) [全長(zhǎng) (44.09±6.89) mm，體質(zhì)量 (0.59±0.32) g)] 于 2019年 6月 27日購(gòu)自常州專業(yè)育苗場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)魚(yú)先放入裝有已提前曝氣 2 d 自來(lái)水的玻璃缸 (長(zhǎng) 100 cm×寬 45 cm×高50 cm) 中暫養(yǎng)。在暫養(yǎng)過(guò)程中每日投喂粉狀普通配合飼料2次。每日清理殘餌、糞便并換水1次，換水量占養(yǎng)殖水體的1/3，同時(shí)在整個(gè)過(guò)程中保持水體持續(xù)充氣增氧。實(shí)驗(yàn)水溫為28～32 ℃，自然光照，不控光周期。熒光染料茜素絡(luò)合物為上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)，包裝規(guī)格為1 g·瓶?1，粉末狀。參考邱晨等[22]使用茜素絡(luò)合物對(duì)鯉 (Cyprinus carpio) 仔魚(yú)的浸泡濃度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組 (0 mg·L?1) 和標(biāo)記組 (100 mg·L?1)。浸泡標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組青魚(yú)均置于實(shí)驗(yàn)專用缸 (長(zhǎng)30 cm×寬 20 cm×高 30 cm) 中。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

本實(shí)驗(yàn)分2個(gè)階段進(jìn)行。第一階段為浸泡標(biāo)記階段。2019年7月12日，從暫養(yǎng)缸中隨機(jī)挑選100尾魚(yú) (已提前饑餓48 h)，將其分別放至含有0和 100 mg·L?1茜素絡(luò)合物實(shí)驗(yàn)用水的上述標(biāo)記專用缸中。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各用1個(gè)缸，每個(gè)缸中均勻放入50尾。為了確保熒光物質(zhì)能被清晰地標(biāo)記上，浸泡時(shí)長(zhǎng)設(shè)為48 h。在浸泡標(biāo)記過(guò)程中魚(yú)體生長(zhǎng)良好，未出現(xiàn)死亡或其他異常情況。第二階段為恢復(fù)續(xù)養(yǎng)階段。當(dāng)浸泡完成后，將魚(yú)苗移至裝有曝氣水體的缸中，使其在里面自由游動(dòng)3 min，然后換水重復(fù)操作3次。用此方法對(duì)魚(yú)體表面進(jìn)行沖洗，去除染液，隨后移至恢復(fù)續(xù)養(yǎng)玻璃缸 (長(zhǎng)100 cm×寬 45 cm×高 50 cm) 中養(yǎng)殖。在浸泡標(biāo)記階段不喂食，當(dāng)移至恢復(fù)續(xù)養(yǎng)玻璃缸后，開(kāi)始正常投喂粉狀普通配合飼料，每日投喂2次，每日清理魚(yú)體排泄物并換水1次，在浸泡標(biāo)記和恢復(fù)續(xù)養(yǎng)的整個(gè)階段中均正常充氣增氧，水溫保持在28～32 ℃，不控光周期。從移至恢復(fù)續(xù)養(yǎng)缸的當(dāng)天計(jì)為第0天開(kāi)始取樣，每次取樣5尾，每5 d取樣1次，取樣至第20天結(jié)束。

1.3 耳石的采樣及標(biāo)記效果檢測(cè)

將樣本魚(yú)放至載玻片上，置于解剖鏡下，用剪刀將魚(yú)體頭部與身體分離，同時(shí)從頭部中間剪開(kāi)，然后用解剖針從左右頭部聽(tīng)囊取出3類耳石；先用去離子水清洗掉耳石上附帶的雜質(zhì)及黏膜，再用無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水、干燥。使用體式顯微鏡對(duì)3類耳石形態(tài)進(jìn)行拍照 (圖 1)。

圖1 青魚(yú)幼魚(yú)的3類耳石a. 矢耳石；b. 微耳石；c. 星耳石。Figure 1 Three types of otoliths from juvenile black carpa. Sagitta; b. Lapillus; c. Asteriscus.

參考邱晨等[22]對(duì)鯉仔魚(yú)熒光標(biāo)記的處理措施，使用無(wú)色透明指甲油將耳石包埋固定在載玻片上 (無(wú)須打磨)，等指甲油完全凝固后，避光保存。通過(guò)日本OLYMPUS BX51型顯微鏡的可見(jiàn)光 (BS)、藍(lán)色激發(fā)光 (WBS)、綠色激發(fā)光 (WGS) 和紫色激發(fā)光 (WUS) 對(duì)其進(jìn)行觀察[23]，比較最適光源，并利用顯微鏡自帶的Stream start軟件進(jìn)行圖譜拍照和圖像處理。耳石標(biāo)記效果參照歐陽(yáng)斌和常劍波[24]的方法按無(wú) (?)、微弱 (+)、較明顯 (++)、明顯 (+++)、非常明顯 (++++) 5個(gè)等級(jí)來(lái)記錄。為了方便對(duì)標(biāo)記效果進(jìn)行判別統(tǒng)計(jì)，本研究將上述5個(gè)等級(jí)的效果按 0 (無(wú))、1 (微弱)、2 (較明顯)、3 (明顯)、4 (非常明顯) 來(lái)記錄。

1.4 耳石熒光標(biāo)記環(huán)時(shí)間差的檢測(cè)

在進(jìn)行耳石熒光標(biāo)記的時(shí)滯觀察時(shí)，由于青魚(yú)已約2月齡，魚(yú)體較大，本研究將經(jīng)無(wú)色透明指甲油包埋的耳石先用4 000目砂紙打磨，直至核心整個(gè)面完全暴露，進(jìn)行拋光確保其表面無(wú)劃痕。后用二甲苯溶液對(duì)包埋耳石的無(wú)色透明指甲油進(jìn)行溶解，在解剖鏡下用解剖針將耳石另外一面朝上，再在其表面用無(wú)色透明指甲油二次固定。對(duì)重新固定的耳石繼續(xù)用4 000目砂紙打磨，直至此面耳石核心也完全暴露，之后對(duì)其進(jìn)行約10 s酸蝕，利用上述BX51型顯微鏡進(jìn)行圖譜拍照得到日輪讀數(shù)，進(jìn)而推算時(shí)滯。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本研究中不同恢復(fù)養(yǎng)殖時(shí)間下標(biāo)記組與對(duì)照組的全長(zhǎng)、體質(zhì)量數(shù)據(jù)采用 Excel 2016軟件進(jìn)行處理分析并作圖，通過(guò)SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)茜素絡(luò)合物浸泡后青魚(yú)生存與生長(zhǎng)狀況

在浸泡標(biāo)記和恢復(fù)續(xù)養(yǎng)過(guò)程中，標(biāo)記組和對(duì)照組的攝食和游泳能力均表現(xiàn)正常。在浸泡標(biāo)記期間，標(biāo)記組和對(duì)照組均未出現(xiàn)死亡，成活率為100%。在恢復(fù)續(xù)養(yǎng)20 d過(guò)程中，標(biāo)記組死亡2尾，對(duì)照組死亡0尾。因標(biāo)記組魚(yú)的死亡發(fā)生于非采樣日，故死亡數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)的采樣和相應(yīng)的測(cè)定無(wú)影響。對(duì)標(biāo)記組和對(duì)照組所采魚(yú)樣本間的全長(zhǎng)和體質(zhì)量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示在恢復(fù)養(yǎng)殖過(guò)程中除第10 天對(duì)照組與標(biāo)記組全長(zhǎng)存在顯著性差異(P<0.05) 外，其他各標(biāo)記組和對(duì)照組全長(zhǎng)與體質(zhì)量差異均不顯著 (P>0.05， 圖 2)。

圖2 不同取樣天數(shù)標(biāo)記組和對(duì)照組青魚(yú)幼魚(yú)的體質(zhì)量和全長(zhǎng)變化 (N=5)*. 兩組間差異顯著 (P<0.05)。Figure 2 Change of body mass and total length of black carp of marking group and control group on different sampling day (N=5)*. Significant difference between two groups (P<0.05).

2.2 3類耳石的熒光標(biāo)記效果

通過(guò)調(diào)節(jié)可見(jiàn)光和不同種類的激發(fā)光，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中熒光標(biāo)記的25尾魚(yú)共150個(gè)耳石 (微耳石、矢耳石、星耳石各50個(gè)) 進(jìn)行觀察 (表1)。以浸泡標(biāo)記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)第10天的青魚(yú)幼魚(yú)耳石為例 (圖3)，在矢耳石、微耳石和星耳石的邊緣均呈現(xiàn)不同顏色的標(biāo)記環(huán)，且標(biāo)記環(huán)信號(hào)強(qiáng)度不同。在可見(jiàn)光和綠色激發(fā)光下，耳石上的熒光標(biāo)記環(huán)呈深紅色，但在可見(jiàn)光下觀察到的顏色偏暗，在綠色激發(fā)光下觀察到的偏亮，更易觀察；在藍(lán)色激發(fā)光和紫色激發(fā)光下，熒光標(biāo)記環(huán)呈橘紅色；不同的是，在藍(lán)色激發(fā)光下，耳石未被標(biāo)記的部分呈綠色，在紫色激發(fā)光下，則呈藍(lán)色。恢復(fù)續(xù)養(yǎng)20 d后 (表1)，在藍(lán)色激發(fā)光下觀測(cè)到總的標(biāo)記強(qiáng)度>3，在綠色激發(fā)光和可見(jiàn)光下觀測(cè)到的標(biāo)記強(qiáng)度<3，其中綠色激發(fā)光略優(yōu)于可見(jiàn)光，在紫色激發(fā)光下觀測(cè)到的標(biāo)記強(qiáng)度<2。對(duì)比在可見(jiàn)光和不同激發(fā)光下3種不同類型耳石的熒光標(biāo)記環(huán)效果，顯示由于耳石的形狀、生長(zhǎng)特性和取樣難易程度不同，其標(biāo)記效果也存在差異。在4種不同的光源下，微耳石上可觀測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度>3，矢耳石上可觀測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度>2，而星耳石的熒光信號(hào)強(qiáng)度則<2；但在可見(jiàn)光下，星耳石的熒光檢測(cè)效果強(qiáng)度則要優(yōu)于另兩種耳石，最接近3。因此，對(duì)于青魚(yú)耳石熒光標(biāo)記效果的檢測(cè)光源，藍(lán)色激發(fā)光最適宜，其后依次為綠色激發(fā)光、可見(jiàn)光和紫色激發(fā)光。在最適激發(fā)光即藍(lán)色激發(fā)光下，微耳石為最佳檢測(cè)耳石類型，但在可見(jiàn)光下用于標(biāo)記最佳檢測(cè)的類型則是星耳石。

2.3 不同恢復(fù)續(xù)養(yǎng)天數(shù)下3類耳石在可見(jiàn)光和不同激發(fā)光下的熒光信號(hào)強(qiáng)度

隨著恢復(fù)續(xù)養(yǎng)天數(shù)的增加，經(jīng)過(guò)茜素絡(luò)合物浸泡的青魚(yú)幼魚(yú)不同耳石熒光標(biāo)記環(huán)強(qiáng)度在可見(jiàn)光和不同激發(fā)光下有不同變化 (表1)。從浸泡標(biāo)記結(jié)束當(dāng)日，即第0天開(kāi)始取樣時(shí)經(jīng)過(guò)48 h浸泡的青魚(yú)幼魚(yú)矢耳石、微耳石、星耳石均已能檢測(cè)到標(biāo)記環(huán)，尤其是在微耳石上觀察到的熒光信號(hào)更為強(qiáng)烈。當(dāng)把浸泡標(biāo)記過(guò)的魚(yú)移到正常水體恢復(fù)續(xù)養(yǎng)后，在此過(guò)程中耳石的日輪繼續(xù)正常生長(zhǎng)，熒光信號(hào)標(biāo)記輪完全形成，此時(shí)熒光標(biāo)記環(huán)不止與浸泡標(biāo)記前的日輪顏色形成對(duì)比，還和浸泡標(biāo)記后新形成的日輪顏色形成對(duì)比，熒光信號(hào)強(qiáng)度極易辨認(rèn)及區(qū)分。隨著恢復(fù)續(xù)養(yǎng)天數(shù)的增加，矢耳石和星耳石的熒光標(biāo)記環(huán)強(qiáng)度均有略微下降的趨勢(shì)，但在藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下直到第20天時(shí)依然能夠在上面觀察到明顯的橘紅色和深紅色的標(biāo)記環(huán)。微耳石則不管是在可見(jiàn)光還是在不同激發(fā)光下均保持較好的標(biāo)記效果，特別是在藍(lán)色激發(fā)光下，從開(kāi)始形成熒光標(biāo)記環(huán)到第20天取樣結(jié)束的過(guò)程中，熒光標(biāo)記環(huán)的強(qiáng)度逐步增加并保持不變 (圖4)?？傮w上在最佳檢測(cè)光源即藍(lán)色激發(fā)光下，微耳石上的熒光標(biāo)記信號(hào)在20 d的恢復(fù)過(guò)程中表現(xiàn)出較好的標(biāo)記效果，且能穩(wěn)定保持。

圖4 青魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)茜素絡(luò)合物浸泡標(biāo)記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)第0、第5、第10、第15和第20天時(shí)微耳石在藍(lán)色激發(fā)光的標(biāo)記效果Figure 4 Marking effect of lapillus of juvenile black carp under blue light source on 0th, 5th, 10th, 15th,20th day of recovery culture after ALC immersion

表1 青魚(yú)幼魚(yú)3類耳石在不同光源下的檢測(cè)效果Table 1 Detection effect of three types of otoliths from juvenile black carp under four different light sources

2.4 茜素絡(luò)合物在青魚(yú)幼魚(yú)耳石上沉積的時(shí)間差

以浸泡標(biāo)記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)第5天的青魚(yú)幼魚(yú)微耳石為例 (圖5)，經(jīng)打磨、酸蝕后耳石日輪顏色加深，能明顯觀察到紫紅色的熒光標(biāo)記環(huán)。由于魚(yú)體日齡較大，因此以觀察到的耳石熒光標(biāo)記環(huán)外部日輪數(shù)倒推茜素絡(luò)合物在青魚(yú)耳石上沉積的時(shí)間差。魚(yú)體在第一日輪形成之后，1日齡即對(duì)應(yīng)1日輪，因此在恢復(fù)續(xù)養(yǎng)第5天進(jìn)行取樣時(shí)，魚(yú)體應(yīng)比浸泡標(biāo)記完成當(dāng)日多生長(zhǎng)出5日輪，但在實(shí)際的日輪觀察中，于自然光下可以看到共有2個(gè)紫紅色標(biāo)記環(huán)的日輪，在紫紅色的標(biāo)記環(huán)外，耳石新生長(zhǎng)出4個(gè)日輪且無(wú)標(biāo)記顏色，即魚(yú)體在在浸泡標(biāo)記的第2天茜素絡(luò)合物開(kāi)始在魚(yú)體的耳石上沉積，進(jìn)入恢復(fù)續(xù)養(yǎng)的第1天熒光標(biāo)記染料仍在其上沉積，因此將魚(yú)體放入茜素絡(luò)合物溶液中與其在耳石上的沉積及將魚(yú)體移出茜素絡(luò)合物溶液與其在耳石上標(biāo)記顏色的消失均存在約 1日輪 (即 1 d) 的時(shí)滯。

圖5 青魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)茜素絡(luò)合物浸泡標(biāo)記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)第5天時(shí)微耳石標(biāo)記效果2個(gè)白色箭頭分別指向微耳石的2條紫紅色標(biāo)記環(huán)；黑色短線表示微耳石新形成的日輪所在位置，即為一明帶和一暗帶組合；4個(gè)黑色箭頭則分別指向微耳石外部新形成的4個(gè)日輪。Figure 5 Marking effect of lapillus of juvenile black carp under four light sources on 5th day of recovery culture after ALC immersionTwo white arrows point to two purple red marker rings in lapillus; the black dash shows the position of the newly formed daily growth increments in lapillus, which is a combination of a bright band and a dark band; the four black arrows point outward to the four newly formed daily growth increments in lapillus.

3 討論

3.1 3類耳石熒光標(biāo)記的差異性

本研究中用可見(jiàn)光和3種不同激發(fā)光對(duì)耳石進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)3類耳石的熒光標(biāo)記效果差異主要取決于青魚(yú)耳石自身的特性及在取樣過(guò)程中的難易程度。由于普通光源對(duì)3類耳石的穿透能力不同[17]，而激發(fā)光具有超強(qiáng)的穿透力，星耳石被標(biāo)記的部分熒光標(biāo)記環(huán)依稀可見(jiàn)，但因其較薄，在可見(jiàn)光下可看到一個(gè)深紅色的標(biāo)記環(huán)；矢耳石的形狀為箭矢型，在生長(zhǎng)過(guò)程中其核心周圍部分變厚、兩端向前延伸變薄，耳石兩端尖細(xì)的部分在前處理過(guò)程中易受外力破壞，造成標(biāo)記環(huán)丟失，因此熒光標(biāo)記環(huán)僅能在局部觀察到，標(biāo)記效果較差 (圖3-a1)；對(duì)于微耳石，整個(gè)耳石為橢圓形，不僅有一個(gè)規(guī)則的外形，且具有一個(gè)明顯且規(guī)則的核心，耳石較厚，在取樣過(guò)程中不易受外力影響，耳石日輪較有規(guī)律地圍繞核心排列生長(zhǎng)，在不同激發(fā)光下均能在耳石邊緣觀察到一個(gè)完整的熒光標(biāo)記環(huán)，因此微耳石的熒光檢測(cè)效果最佳。但由于耳石較厚，在可見(jiàn)光下的標(biāo)記環(huán)較難觀察到，考慮到對(duì)日輪進(jìn)行觀察時(shí)需要計(jì)數(shù)，要求輪紋的排列整齊有序，此時(shí)矢耳石和星耳石就變得不可選擇，可對(duì)微耳石打磨后觀察標(biāo)記效果。因此，進(jìn)行標(biāo)記效果檢測(cè)且需同時(shí)觀察日輪時(shí)，可優(yōu)先考慮用微耳石。而邱晨等[25]觀察鯽(Carassius auratus) 幼魚(yú)的熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在激發(fā)光下對(duì)星耳石熒光標(biāo)記觀測(cè)效果優(yōu)于微耳石和星耳石，而在可見(jiàn)光下微耳石的標(biāo)記效果則優(yōu)于另兩種，這可能是由于不同種類的魚(yú)體耳石存在形成差異所致。

圖3 經(jīng)茜素絡(luò)合物標(biāo)記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)第10天時(shí)青魚(yú)幼魚(yú)矢耳石、微耳石、星耳石分別在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光、綠色激發(fā)光和紫色激發(fā)光下的標(biāo)記效果a1. 矢耳石分別在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光、綠色激發(fā)光和紫色激發(fā)光下的標(biāo)記效果；b1. 微耳石分別在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光、綠色激發(fā)光和紫色激發(fā)光下的標(biāo)記效果；c1. 星耳石分別在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光、綠色激發(fā)光和紫色激發(fā)光下的標(biāo)記效果；圖中白色箭頭表示由矢耳石、微耳石、星耳石核心指向熒光標(biāo)記輪。Figure 3 Marking effect of three types of otoliths of juvenile black carp under different light sources on 10th day of recovery culture after ALC immersiona1. Marking effect of sagitta under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light; b1. Marking effect of lapillus under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light; c1. Marking effect of asteriscus under visible light,blue excitation light, green excitation light and purple excitation light. The white arrows show that the core of sagitta,lapillus and asteriscus point to the fluorescent marker ring.

3.2 影響青魚(yú)耳石熒光標(biāo)記效果的因素

熒光標(biāo)記效果受到浸泡標(biāo)記濃度和時(shí)間的制約。一般標(biāo)記濃度越高，浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，熒光標(biāo)記產(chǎn)生的效果越好[24]。但在實(shí)踐中應(yīng)考慮經(jīng)濟(jì)成本且高濃度溶液長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能會(huì)對(duì)魚(yú)體的生理活動(dòng)產(chǎn)生一定影響，因此需選擇適當(dāng)?shù)慕轁舛群徒輹r(shí)間。趙亞鵬等[26]用不同濃度的茜素絡(luò)合物溶液標(biāo)記滇池金線鲃 (Sinocyclocheilus grahami)，結(jié)果顯示溶液質(zhì)量濃度達(dá)到150 mg·L?1時(shí)仔魚(yú)已經(jīng)開(kāi)始死亡，大于 200 mg·L?1時(shí) 90日齡稚魚(yú)全部死亡。劉清等[27]在進(jìn)行鳙 (Aristichthys nobilis) 耳石茜素絡(luò)合物標(biāo)記時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相較于24 h的標(biāo)記時(shí)間，48 h的鮮艷程度和標(biāo)記效果更好，因此對(duì)于仔幼魚(yú)來(lái)說(shuō)質(zhì)量濃度應(yīng)盡量小于 150 mg·L?1，且以48 h的浸泡時(shí)長(zhǎng)較適宜。此外，在相同的浸泡時(shí)間下，隨著茜素絡(luò)合物濃度增加，耳石上標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度增大，實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡率也升高；同時(shí)在相同的浸泡濃度下，隨著時(shí)間的增加，耳石上標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度增大，實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡率也升高[18]。值得注意的是，相較于淡水魚(yú)類，海洋魚(yú)類可能會(huì)有所不同，Becker等[7]對(duì)日本白姑魚(yú) (Argyrosomus japonicus) 用不同的浸泡時(shí)間 (6、12和 24 h) 和不同浸泡質(zhì)量濃度(0、100、150和 200 mg·L?1) 結(jié)合來(lái)標(biāo)記，在最長(zhǎng)浸泡時(shí)間 (24 h) 與最大質(zhì)量濃度 (200 mg·L?1) 組合下標(biāo)記效果最好，且未出現(xiàn)死亡。因此，在浸泡標(biāo)記魚(yú)體過(guò)程中，對(duì)于不同魚(yú)類，要想在不影響魚(yú)體正常生命活動(dòng)的前提下達(dá)到理想的標(biāo)記效果，對(duì)浸泡濃度和浸泡時(shí)間的研究則非常必要。

熒光標(biāo)記效果除了與標(biāo)記條件 (如濃度、時(shí)間等) 密切相關(guān)外，還與標(biāo)記魚(yú)的生活史及發(fā)育階段關(guān)系密切。Unfer和Pinter[9]用茜素紅標(biāo)記褐鱒(Salmo trutta) 的胚胎耳石，不僅死亡率低、標(biāo)記成功率高，而且也降低了成本。靳建波等[28]對(duì)秦嶺細(xì)鱗鮭 (Brachymystax lenok tsinlingensis) 的發(fā)眼卵和仔稚魚(yú)進(jìn)行茜素絡(luò)合物標(biāo)記，也發(fā)現(xiàn)發(fā)眼卵需要的標(biāo)記濃度更低，但標(biāo)記效果卻更好。考慮到不同規(guī)格的魚(yú)種對(duì)茜素絡(luò)合物耐受限度不同，王正鯤等[17]用不同規(guī)格唐魚(yú) (Tanichthys albonubes) 進(jìn)行茜素絡(luò)合物浸泡，發(fā)現(xiàn)最適濃度不盡相同，其仔稚魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的最適質(zhì)量濃度分別為80、100和 150 mg·L?1。徐永江等[18]用茜素絡(luò)合物對(duì)半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis) 進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn) 70 d魚(yú)苗的標(biāo)記效果要優(yōu)于170 d的魚(yú)苗。Cottingham等[16]用茜素絡(luò)合物對(duì)布氏棘鯛 (Acanthopagrus butcheri) 幼魚(yú)進(jìn)行標(biāo)記，其耳石上的標(biāo)記效果能保持16年之久。因此熒光標(biāo)記一般對(duì)早期生活史階段的個(gè)體效果更好。本實(shí)驗(yàn)中，由于魚(yú)體已達(dá)幼魚(yú)階段，直接以較為保守的 100 mg·L?1進(jìn)行 48 h 浸泡探索，在魚(yú)體的3類耳石上均能夠檢測(cè)到標(biāo)記，獲得了不錯(cuò)的標(biāo)記效果。

3.3 茜素絡(luò)合物在青魚(yú)幼魚(yú)耳石上沉積時(shí)間差的影響因素

激發(fā)光的光源具有衍射性，故對(duì)魚(yú)體耳石進(jìn)行日輪觀察時(shí)應(yīng)在可見(jiàn)光下進(jìn)行。經(jīng)茜素絡(luò)合物浸泡標(biāo)記后的耳石日輪在可見(jiàn)光下呈紫紅色，但隨著魚(yú)體的生長(zhǎng)，耳石日輪逐漸密集，即使在可見(jiàn)光下對(duì)日輪數(shù)目的觀察也需經(jīng)過(guò)一些特殊處理，以便于對(duì)耳石日輪數(shù)目進(jìn)行計(jì)算。迄今，就魚(yú)體標(biāo)記的時(shí)滯問(wèn)題報(bào)道較少，朱亞華等[29]研究了經(jīng)茜素絡(luò)合物浸泡的草魚(yú) (Ctenopharyngoclon idellus) 耳石時(shí)滯，發(fā)現(xiàn)魚(yú)體開(kāi)始浸泡和轉(zhuǎn)移出標(biāo)記溶液與標(biāo)記環(huán)的出現(xiàn)和消失存在約12 h時(shí)滯；邱晨等[22]對(duì)經(jīng)茜素絡(luò)合物標(biāo)記的鯉仔魚(yú)標(biāo)記環(huán)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)耳石上熒光信號(hào)出現(xiàn)和消失的時(shí)間與魚(yú)體浸泡開(kāi)始和結(jié)束的時(shí)間存在1 d時(shí)滯，但用鍶 (Sr) 溶液對(duì)鯉仔魚(yú)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn)，在浸泡后第3天耳石上才開(kāi)始出現(xiàn)Sr標(biāo)記，在浸泡結(jié)束后第6天Sr標(biāo)記區(qū)才完全消失[30]；本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之相似。由此可見(jiàn)，元素在魚(yú)體耳石上沉積的時(shí)間差不僅與被標(biāo)記的種類有關(guān)，更與標(biāo)記的物質(zhì)相關(guān)。這可能與魚(yú)類對(duì)不同化學(xué)物質(zhì)的代謝速率有關(guān)[31]。

4 結(jié)論

本研究表明，使用茜素絡(luò)合物對(duì)青魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行浸泡，其3類耳石在可見(jiàn)光和不同激發(fā)光下均可見(jiàn)明顯的標(biāo)記環(huán)，標(biāo)記率達(dá)100%。最佳觀察光源為藍(lán)色激發(fā)光，其次是綠色激發(fā)光。標(biāo)記觀察的最適耳石類型為微耳石。在長(zhǎng)達(dá)20 d的恢復(fù)續(xù)養(yǎng)過(guò)程中，熒光標(biāo)記環(huán)信號(hào)強(qiáng)度保持穩(wěn)定。從用茜素絡(luò)合物溶液開(kāi)始浸泡魚(yú)體至其在耳石上產(chǎn)生沉積和將魚(yú)移出溶液至標(biāo)記在耳石上消失均存在約1 d的時(shí)滯。用茜素絡(luò)合物化學(xué)標(biāo)記青魚(yú)幼魚(yú)的方法有效且適用，這對(duì)于區(qū)分人工放流和野生種群，把握增殖放流青魚(yú)對(duì)自然資源量恢復(fù)的貢獻(xiàn)作用等研究有一定的參考價(jià)值。