豬腹膜脫細胞基質(zhì)聯(lián)合微骨折技術(shù)修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損

孟慶陽 胡曉青 黃洪杰 劉振龍 敖英芳

北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京 100191）

豬腹膜脫細胞基質(zhì)聯(lián)合微骨折技術(shù)修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損

孟慶陽 胡曉青 黃洪杰 劉振龍 敖英芳

北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京 100191）

目的：檢測豬腹膜脫細胞基質(zhì)（pig peritoneum-derived acellular matrix，PPAM）支架材料聯(lián)合微骨折修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。方法：采用CCK-8 Kit測定SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）在PPAM支架上的生長狀態(tài)，Live/Dead染色觀察細胞在PPAM支架上的活性。用直徑4mm環(huán)鉆造成深度約1.5 mm的新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，微骨折術(shù)后將PPAM支架植入軟骨缺損處，單純微骨折技術(shù)（Microfracture，MF）作為對照組，分別在第6周、12周和24周取材。大體觀察、HE染色、甲苯胺藍染色和II型膠原（COL II）免疫組化染色檢測軟骨缺損修復的效果。結(jié)果：CCK-8 Kit和Live/Dead染色結(jié)果顯示PPAM支架支持細胞生長和增殖，無細胞毒性。大體觀察和組織學檢測顯示PPAM聯(lián)合MF修復軟骨缺損能促進軟骨缺損填充組織的質(zhì)量，組織學評分優(yōu)于單純MF組。結(jié)論：PPAM支架是一種有良好生物相容性的天然材料來源組織工程材料，聯(lián)合MF技術(shù)能促進關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復。

軟骨修復；脫細胞基質(zhì)；微骨折；組織工程

由于缺乏足夠的營養(yǎng)和前體細胞，關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷極難修復[1]。目前關(guān)節(jié)軟骨損傷修復方法主要是微骨折/鉆孔法、“馬賽克”法軟骨移植、自體軟骨細胞移植、組織工程技術(shù)等。微骨折法操作簡單，適合關(guān)節(jié)鏡下進行，是臨床修復軟骨損傷的一線治療方法。但研究表明，微骨折法修復軟骨缺損的填充組織主要成分是纖維軟骨，力學特性較差，表面粗糙不平，并且遠期發(fā)生降解碎裂[2]。因此，在微骨折技術(shù)的基礎(chǔ)上，輔助組織

工程支架植入，能有效提高軟骨缺損處填充組織的質(zhì)量，是一種較為有效的軟骨修復方法[3]。

天然組織經(jīng)脫脂、脫細胞處理后形成的脫細胞基質(zhì)，其孔隙結(jié)構(gòu)更適合細胞貼附、生長和增殖，分泌較多的細胞外基質(zhì)[4]。此外，良好的生物相容性和無毒性代謝產(chǎn)物，都使得脫細胞基質(zhì)材料在組織工程修復軟骨缺損中具備優(yōu)勢[5]。本研究采用豬腹膜來源的脫細胞基質(zhì)材料，聯(lián)合微骨折技術(shù)，來探討修復軟骨缺損的效果。

1 材料與方法

1.1豬腹膜脫細胞基質(zhì)

本支架材料由陜西佰傲再生醫(yī)學有限公司提供（商品名：誘導軟骨再生膜；型號：GCRM-4030），大小為4 cm×3 cm，厚度約300～500 μm。來源于豬腹膜組織片，經(jīng)脫細胞、脫脂處理后射線滅菌。使用前將支架制成直徑4 mm大小的PPAM片，分裝后鈷60照射滅菌貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2BMMSCs細胞培養(yǎng)和PPAM生物相容性檢測

6周齡SD大鼠乙醚麻醉后脫頸處死，75%酒精中浸泡10 min消毒。然后在超凈臺下無菌切開后肢皮膚，仔細剔除股骨周圍的肌肉、筋膜等組織，離斷股骨后用無菌PBS反復沖洗骨髓腔。將骨髓腔沖洗液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中960轉(zhuǎn)/分離心4 min，棄上清后加入α-MEM培養(yǎng)基重新混懸，然后接種在10 cm培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。棄去舊培養(yǎng)基，PBS輕柔沖洗后加入新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察原代BMMSCs細胞達到80%融合率后傳代。本實驗所用BMMSCs為三代細胞（P3）。

取12孔板，每孔底部平鋪無菌的不粘附性Parafilim膜，將直徑4 mm的PPAM置入。將P3 BMMSCs混懸后調(diào)整成106/ml的細胞懸液，取100 μl滴加到PPAM上，37℃、5%CO2孵箱中孵育30 min，然后每孔補充2 ml α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在1、3、5和7天時取出支架，PBS沖洗2次后加入CCK-8 Kit工作液孵育1 h，在多功能酶標儀中測定OD值。

按上述同樣操作接種細胞，72 h后取出PPAM支架，PBS沖洗2次。將Live/Dead試劑A加入到試劑B中配成工作液，每支架加入100 μl Live/Dead工作液，室溫下避光孵育30 min，然后PBS沖洗2次，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3手術(shù)過程

選擇3月齡成年雄性新西蘭大白兔，體重約2.5～3 kg。按照1.5 ml/kg的劑量耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉誘導麻醉，0.2 ml/kg的劑量肌肉注射陸眠寧/氯胺酮混合液（體積比為1：1）維持麻醉狀態(tài)。常規(guī)脫毛備皮，膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路依次切開皮膚、皮下組織、關(guān)節(jié)囊，將髕骨推向外側(cè)脫位并屈膝保持，充分暴露股骨滑車。用直徑4 mm的角膜環(huán)鉆在股骨滑車區(qū)關(guān)節(jié)面上鉆取深約2 mm的軟骨缺損，深度以不鉆透軟骨下骨為宜，取出軟骨塊，修整軟骨缺損基底，用2 ml注射器針頭刺透軟骨下骨，見骨髓腔中血液滲出。將PPAM支架填塞進缺損內(nèi)，用雙腔推液器注射纖維蛋白膠（倍繡膠）A工作液和B工作液，5 min后可見纖維蛋白膠形成，支架固定于軟骨缺損處。復位關(guān)節(jié)，逐層縫合關(guān)節(jié)腔。術(shù)后三天內(nèi)肌注頭孢唑林鈉0.2 g/kg，自由籠養(yǎng)12周、24后取材。

圖1 手術(shù)過程

1.4關(guān)節(jié)軟骨修復效果評估

1.4.1兔膝關(guān)節(jié)大體標本獲取及處理

兔2%戊巴比妥鈉過量麻醉處死，逐層打開膝關(guān)節(jié)皮膚、皮下組織、關(guān)節(jié)囊，離斷兔膝關(guān)節(jié)股骨端，剔除周圍肌肉、韌帶等軟組織。PBS沖洗標本5 min，觀察圖膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復情況并拍照記錄。大體觀察完成后將標本置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后置于快速脫鈣液中脫鈣72 h。修整標本，將含有軟骨缺損的區(qū)域取出，置于包埋盒中流水沖洗3 h，70%酒精中浸泡30 min。自動脫水機中脫水過夜，常規(guī)石蠟包埋。

1.4.2組織學染色

1.4.2.1HE染色

石蠟包埋標本常規(guī)切片、展片、撈片、烤片，將切片在自動染片機中進行HE染色，中性樹脂封片后通風櫥中風干，采集圖像。

1.4.2.2甲苯胺藍染色

將切片在自動染片機中脫蠟至水，甲苯胺藍染色8 min，自來水洗去浮色，95%酒精中脫水2 s，100%酒精中脫水2 s，二甲苯替代物溶液中透明1 min，中性樹脂封片后通風櫥中風干，采集圖像。

1.4.2.3免疫組化染色

將切片在自動染片機中脫蠟至水，3%H2O2去離子水15 min，PBS沖洗3次每次3 min；胃蛋白酶抗原修復30 min，37°C避光孵育，PBS沖洗3次每次3 min；小鼠抗兔COL II或COL I抗體4°C過夜；PBS沖洗3 min，3次；二抗37°C孵育30 min；PBS沖洗3 min，3次；DAB顯色；流水沖洗3 min；蘇木精復染細胞核5 min，自來水洗去浮色，分色2 s，返藍2 s，95%酒精中脫水2 s；100%酒精中脫水2 s；二甲苯替代物溶液中透明1 min，2次；中性樹脂封片后通風櫥中風干，采集圖像。

1.4.2.4組織學評分

根據(jù)軟骨修復的組織學評分系統(tǒng)對組織學染色進行評分。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行標準誤、單因素方差分析統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，當P值小于0.05時，差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1生物相容性

2.1.1CCK-8 Kit

從圖2可看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD值逐漸升高，亦即細胞量逐漸增多，說明PPAM支持細胞生長和增殖，無明顯細胞毒性。在細胞接種第5天時，OD值明顯高于第1天和第3天，但與第7天無明顯差異，可能與支架上細胞增殖到一定數(shù)量，生長空間有限有關(guān)。

圖2 CCK-8 Kit測定不同時間點的OD值

2.1.2Live/Dead染色

從Live/Dead染色圖像中可以看到，BMMSCs細胞保持長梭形，代表活細胞的綠色多，而代表死細胞的紅色較少，說明PPAM能支持細胞保持相應(yīng)表型，對細胞活性無影響，無細胞毒性。

圖3 Live/Dead染色激光共聚焦圖像

2.2軟骨修復效果

2.2.1大體觀察

在術(shù)后6周，微骨折組軟骨缺損處基本無填充，凹陷明顯，與周圍正常軟骨有明顯界限；PPAM組軟骨缺損處填充也不完全，但較微骨折組填充程度多。術(shù)后12周時，兩組軟骨缺損填充均明顯增多，基本與周圍正常軟骨達到同一高度。但微骨折組填充組織內(nèi)部有較大不融合缺口。術(shù)后24周，兩組軟骨缺損進一步填充，表面基本與正常軟骨齊平，但微骨折組呈現(xiàn)明顯的白色纖維軟骨樣，PPAM組則較為透亮。

圖4 術(shù)后6、12和24周時軟骨缺損修復情況大體觀

2.2.2 組織學染色

術(shù)后6周時，HE染色顯示微骨折組基本無填充，缺損底部可見血凝塊殘留，可見少量纖維狀組織，細胞量極少；PPAM組有部分填充，但缺損處和正常軟骨仍有差距，組織細胞較多，結(jié)構(gòu)較密。甲苯胺藍染色顯示微骨折組填充組織基本呈陰性染色，說明分泌的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）較少；PPAM組修復組織著色較淺，但較微骨折組染色深，說明此時有少量ECM分泌。COL II免疫組化染色也和甲苯胺藍染色結(jié)果相一致，兩組著色均較淺，說明6周時還未合成較多的II型膠原。COL I免疫組化染色顯示微骨折組著色較淺，基本無COL I的分泌，而由于支架成分是I型膠原的緣故，PPAM組著色稍深。

術(shù)后12周時，HE染色顯示微骨折組填充增多，但仍為纖維狀組織，細胞量少，結(jié)構(gòu)疏松；PPAM組填充也增多，結(jié)構(gòu)較為致密，細胞量較多。甲苯胺藍染色顯示微骨折組填充組織基本呈陰性染色，說明分泌的ECM仍較少；PPAM組修復組織著色變淺，但與正常軟骨仍有明顯差別，說明此時軟骨ECM分泌仍不多。COL II免疫組化染色顯示微骨折組著色較淺，PPAM組著色加深，說明II型膠原合成明顯增多。COL I染色結(jié)果顯示，微骨折組和PPAM組均有I型膠原的合成，PPAM組著色稍深。

術(shù)后24周時，HE染色顯示微骨折組填充高度已達正常軟骨，但呈纖維軟骨樣，結(jié)構(gòu)疏松，與正常軟骨融合不佳，且組織內(nèi)部出現(xiàn)裂隙；PPAM組填充接近正常軟骨，結(jié)構(gòu)較為致密，細胞量較多，與正常軟骨之間可見交界線，但融合性好。甲苯胺藍染色顯示微骨折組填充組織底部呈陽性染色，上層組織染色較淺，說明修復組織內(nèi)底部含較多的軟骨ECM，但上層組織缺乏；PPAM組修復組織著色較深，已基本接近正常軟骨，說明此時PPAM組軟骨ECM分泌接近正常軟骨。COL II免疫組化染色顯示微骨折組著色較淺，PPAM組著色較深，說明微骨折組修復組織的II型膠原合成較少，而PPAM組合成較多。COL I染色結(jié)果顯示，微骨折組和PPAM組均有I型膠原的合成，微骨折組可見局部深染，證實了I型膠原成分為主，而PPAM組的著色和周圍正常軟骨的著色已基本接近。

圖5 術(shù)后6、12和24周時軟骨缺損修復的HE染色

圖6 術(shù)后6、12和24周時軟骨缺損修復的甲苯胺藍染色

圖7 術(shù)后6、12和24周時軟骨缺損修復的COL II免疫組化染色

圖8 術(shù)后6、12和24周時軟骨缺損修復的COL I免疫組化染色

3 討論

由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏足夠的營養(yǎng)和前體細胞，一旦損傷，很難靠自身修復[6]。未深達軟骨下骨板的軟骨缺損，無修復能力，經(jīng)長期磨損后會造成周圍正常軟骨的退變，進而產(chǎn)生關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)障礙。深達軟骨下骨板的軟骨缺損，可以產(chǎn)生修復組織，但主要成分是纖維軟骨，其生物力學性能遠不如正常軟骨[7]。盡管微骨折手術(shù)可以在一定程度上緩解關(guān)節(jié)疼痛和填充缺損，但遠期療效并不理想。因此，利用生物材料聯(lián)合微骨折技術(shù)，提高修復組織的透明軟骨含量，是目前治療的重要策略。

本研究采用的豬腹膜脫細胞基質(zhì)支架，具有特殊結(jié)構(gòu)：致密層和疏松層。致密層可以截留細胞，疏松層雜亂排列的膠原纖維，一方面利于截留細胞，另一方面有利于細胞貼附。從激光共聚焦圖像（圖3）中可以看出，細胞沿膠原纖維束貼附生長，細胞活性好，說明支架材料具有良好的生物相容性。在動物實驗中，也發(fā)現(xiàn)PPAM組組織填充的細胞量較多，組織結(jié)構(gòu)更為致密（圖5、6、7）。CCK-8 Kit的結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時間延長，支架上的細胞量逐漸增多，說明細胞在支架上增殖良好（圖2）。

良好的生物降解性、無毒性代謝產(chǎn)物是組織修復成功的重要影響因素。在本實驗中，6周時的組織學染色結(jié)果表明，此時的PPAM支架已完全降解，說明支架具有良好的生物降解性。同時，修復組織內(nèi)未見明顯的嗜酸粒細胞浸潤，說明其代謝產(chǎn)物無明顯毒性，不會引起明顯的炎性反應(yīng)。

豬腹膜組織經(jīng)脫脂、脫細胞處理后，殘留的結(jié)構(gòu)內(nèi)含有生物因子等ECM成分，將有益于促進骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化。采用微骨折聯(lián)合豬腹膜脫細胞基質(zhì)進行軟骨修復，具有以下明顯優(yōu)勢：（1）支架的特殊結(jié)構(gòu)有利于骨髓間充質(zhì)干細胞的存留和貼附，從而有利于細胞增殖和ECM分泌；（2）脫細胞基質(zhì)內(nèi)的生物因子，有利于骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化；（3）本方法一次完成，方便快捷，有臨床應(yīng)用的優(yōu)勢。

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Application of Combined Pig Peritoneum-derived Acellular Matrix and Microfracture Technique for Repairing Articular Cartilage Defect in Rabbit

Meng Qingyang，Hu Xiaoqing，Huang Hongjie，Liu Zhenlong，Ao Yingfang
Institution of Sports Medicine，the Third Affiliated Hospital of Peking University，Beijing，China 100191 Corresponding Author：Ao Yingfang，Email：aoyingfang@163.com

Objective To evaluate the outcome of articular cartilage repair using pig peritoneum-derived acellular peritoneum matrix（PPAM）in combination with microfracture（MF）technique in rabbit.Methods The growth of bone marrow-derived mesenchymal stem cells（BMMSCs）and the activity of BMMSCs on the PPAM was respectively observed by CCK-8 Kit and Live/Dead staining.The cartilage defect（4mm in diameter and 1.5mm in depth）in knee trochlea of rabbit was made by a trephine.A part of the defects was implanted with PPAM in treatment group，and the remaining defects were served as MF group.Gross observation，HE staining，toluidineblue staining and immunohistochemical staining of collagen type II were used to evaluate the outcome of articular cartilage repair at 6，12 and 24 weeks after the operation.Results The PPAM supported the growth and proliferation of BMMSCs well enough without any cytotoxicity.The histological score in treatment group was significantly higher than in the MF group.Conclusions The combination of PPAM and microfracture technique was beneficial for articular cartilage repair due to its good biocompatibility.

cartilage repair，acellular matrix，microfracture，tissue engineering

2016.05.03

國家自然科學基金重點項目（81330040）

敖英芳，Email：aoyingfang@163.com