洛龍黨參總皂苷提取純化工藝研究

張梅麗，謝卓良，宋亞會，辛慶燕，余 蘭

（遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563099）

黨參來源于桔?？浦参稂h參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）屬的干燥根，其性味甘，性平，可用于脾肺氣虛、食少倦怠、氣血不足等癥狀的治療，是中國傳統(tǒng)補(bǔ)中益氣的中藥材［1，2］。黨參的主要成分包括皂苷類、生物堿類、炔類、黃酮類、木質(zhì)素類、糖類等［3，4］，其中皂苷作為黨參的主要功效成分之一，具有明顯的抗菌、抗腫瘤、抗炎等藥理學(xué)活性［5-7］。

目前，皂苷的主要提取方法有超聲提取法、微波提取法、回流提取法等［8］。超聲波輔助提取法的提取率高，但易破環(huán)有效成分的結(jié)構(gòu)，且不適用于大批量工業(yè)生產(chǎn)［9］，微波提取法則存在設(shè)備成本大以及產(chǎn)品回收率低等缺點(diǎn)［10］，回流提取法可以減少溶劑的消耗，提高浸出效率，同時有利于對皂苷成分的保護(hù)，廣泛用于工業(yè)大規(guī)模的生產(chǎn)。皂苷的提取伴隨多種化學(xué)物質(zhì)的浸出，所以需要對皂苷進(jìn)行純化，其常用方法有大孔樹脂吸附法、離子沉淀法和膜過濾法，其中大孔吸附樹脂以純化效率高、選擇性高、可循環(huán)再生使用等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于皂苷的純化［11，12］。

洛龍黨參是川黨參（Codonopsis tanshenOliv.）的生態(tài)型變種，以肉質(zhì)根條肥大、無硬心出名，可入藥或食用，是貴州省道真縣特有的黨參食用品種［13，14］，但由于對洛龍黨參的研究開發(fā)起步較晚，目前缺乏對洛龍黨參營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)性研究，如果能有效利用洛龍黨參中的功能性成分，則可以創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)和社會效益，將很大程度上推動當(dāng)?shù)氐陌l(fā)展。本試驗(yàn)以洛龍黨參為原料，通過正交優(yōu)化乙醇回流提取皂苷工藝參數(shù)，并采用大孔樹脂對總皂苷進(jìn)行純化，旨在為洛龍黨參功能性成分的深度開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洛龍黨參購自貴州省遵義市道真縣洛龍鎮(zhèn)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院楊建文教授鑒定為桔梗科植物川黨參（Codonopsis tanshenOliv.）；洛龍黨參粉由實(shí)驗(yàn)室自制，過65目篩。人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號110754-201123）；D101、HPD-100、SA-1、AB-8型大孔樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司）；乙醇、正丁醇、甲醇、高氯酸、冰醋酸香草醛均為分析純（成都金山化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；HH-St二列六孔水浴鍋（鄭州長城科技貿(mào)有限公司）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-ⅢG型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；79CS型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 方法

1.3.1 洛龍黨參總皂苷含量的測定方法 采用高氯酸-冰醋酸法［15］測定。精密稱取人參皂苷Re對照品2.50 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，量取配置好的對照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置于具塞干燥試管中，水浴蒸干，加入現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，充分混勻，置于60℃恒溫水浴中加熱15 min，放入冰水浴中冷卻5 min，最后加5 mL冰醋酸終止反應(yīng)，搖勻，以空白試劑作對照，于最大吸收波長540 nm處測其吸光度，分別以濃度、吸光度為橫、縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取干燥洛龍黨參5.00 g，置于150 mL圓底燒瓶，加入一定量濃度的乙醇溶液混合均勻后，在一定溫度下回流提取一定時間，過濾，提取2次，合并濾液并濃縮，蒸餾水稀釋后用等體積飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓濃縮后用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中。精密吸取待測樣品溶液50μL，置于具塞干燥試管，待水浴蒸干后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定，于540 nm測量吸光度。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 在料液比1∶20，乙醇濃度70%，提取時間90 min的條件下，分別考察提取溫度50、60、70、80、90℃對洛龍黨參總皂苷提取率的影響；在提取溫度70℃，乙醇濃度70%，提取時間90 min的條件下，分別考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對洛龍黨參總皂苷提取率的影響；在提取溫度70℃，提取時間90 min，料液比1∶25的條件下，分別考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對洛龍黨參總皂苷提取率的影響；在提取溫度70℃，料液比1∶25，乙醇濃度70%的條件下，分別考察提取時間30、60、90、120、150 min對洛龍黨參總皂苷提取率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以洛龍黨參總皂苷提取率為指標(biāo)，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4個影響因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取參數(shù)，正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交因素水平

1.3.4 洛龍黨參總皂苷的純化方法

1）大孔樹脂預(yù)處理：取適量的不同型號的大孔樹脂置于燒杯中，加入95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后濕法裝柱，用95%乙醇沖洗大孔樹脂至流出液與水混合后無白色混濁，再用去離子水沖洗至流出液無醇味，備用［16］。

2）大孔樹脂型號的選擇：量取已經(jīng)預(yù)處理后的D101、AB-8、HPD-100和SA-1型大孔樹脂各1 g置于具塞錐形瓶中，分別加入相同質(zhì)量濃度的洛龍黨參總皂苷提取液10 mL，于室溫下振搖5 h使其達(dá)到飽和吸附，然后取出靜置，過濾，收集濾液于10 mL容量瓶中定容至刻度。吸附量和吸附率的計(jì)算公式如下：

式中，Qe為吸附量，mg/g；Q2為吸附率，%；C0為總皂苷初始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為吸附平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；Vi為樣品體積，mL；W為大孔樹脂質(zhì)量，g。

將過濾后的大孔吸附樹脂分別加入90%乙醇20 mL，于室溫下振搖2 h使其充分解吸，取出，過濾，收集濾液于25 mL容量瓶中定容至刻度。解吸量和解吸率的計(jì)算公式如下：

式中，Qd為解吸量，mg/g；D為解吸率，%；Cd為解吸液中總皂苷質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為解吸液體積，mL。

根據(jù)靜態(tài)吸附試驗(yàn)所得結(jié)果，篩選出最適合洛龍黨參總皂苷純化的大孔吸附樹脂，并將洛龍黨參總皂苷配置成2 mg/mL粗提液，按照2 BV/h流速上柱吸附，每1 BV收集一份流出液，共收集10份，測定相應(yīng)吸光度，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)作泄露曲線。

3）上樣液濃度對吸附效果的影響：分別精密配置洛龍黨參總皂苷粗提液濃度2.00、3.50、5.00、6.50、8.00 mg/mL，按2 BV/h的流速上柱吸附，分別考察不同粗提液濃度對吸附效果的影響，收集樹脂柱洗脫液，濃縮，于10 mL容量瓶中定容，測定吸光值，計(jì)算吸附量。

4）不同乙醇濃度對洗脫效果的影響：取已經(jīng)預(yù)處理的大孔吸附樹脂裝柱，上樣液濃度為5 mg/mL，以2 BV/h流速上柱吸附，待樣品被樹脂充分吸附后，以2 BV/h的流速5 BV水洗柱，再分別用0、20%、50%、70%、90%乙醇進(jìn)行洗脫，比較不同乙醇濃度對洗脫效果的影響。每個濃度各洗脫5 BV，收集后定容于25 mL容量瓶，測定吸光值，計(jì)算洗脫率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對總皂苷提取率的影響 由圖1可知，當(dāng)提取溫度為50～70℃時，總皂苷提取率呈上升趨勢，70～80℃時上升趨勢較緩，超過80℃后提取率開始下降。當(dāng)提取溫度為80℃時提取液色素較高，溫度耗能太大，在實(shí)際生產(chǎn)中易造成成本的增加，且溫度過高也會導(dǎo)致部分皂苷性成分的分解，綜合考慮，選取70℃為最佳提取溫度。

圖1 不同提取溫度對總皂苷提取率的影響

2.1.2 料液比對總皂苷提取率的影響 由圖2可知，隨料液比的增加，總皂苷提取率整體呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)料液比1∶20時上升趨勢開始放緩，考慮到溶劑用量過多會導(dǎo)致成本增加，因此選取1∶25為最佳料液比。

圖2 不同料液比對總皂苷提取率的影響

2.1.3 提取時間對總皂苷提取率的影響 由圖3可知，隨提取時間增加，總皂苷提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)提取時間達(dá)到90 min時提取率最高，隨后緩慢下降，原因可能是隨著提取時間的延長，雜質(zhì)的溶出度增加，致使總皂苷的提取率降低，因此選取90 min為最佳提取時間。

圖3 不同提取時間對總皂苷提取率的影響

2.1.4 乙醇濃度對總皂苷提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度為50%～70%時，總皂苷提取率上升幅度明顯，但當(dāng)乙醇濃度為70%～90%時，提取率增加趨勢減緩?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)成本問題，選取70%乙醇濃度為最佳提取濃度。

圖4 不同乙醇濃度對總皂苷提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)與方差分析結(jié)果 由表2可知，洛龍黨參總皂苷回流提取試驗(yàn)影響因素大小的順序依次為提取時間、料液比、提取溫度、乙醇濃度，最佳組合因素為A1B2C2D2，即在乙醇濃度70%，料液比1∶25，提取溫度70℃，提取時間90 min的條件下，提取率最高，達(dá)到2.15%，經(jīng)方差分析（表3），提取時間和料液比對洛龍黨參總皂苷提取率的影響達(dá)到了顯著水平，其他因素不顯著。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交方差分析

2.2.2 正交工藝驗(yàn)證 精密稱取干燥洛龍黨參5.00 g，按正交優(yōu)化后的工藝乙醇回流提取洛龍黨參總皂苷3次，提取率分別為2.11%、2.19%、2.15%，平均值為2.15%，表明該組合工藝條件下提取皂苷的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果 比較D101、AB-8、HPD-100、SA-1型4種不同性質(zhì)的大孔樹脂的吸附率和洗脫率，由表4可知，HPD-100型大孔樹脂吸附率是最高的，SA-1型大孔樹脂洗脫率最高，綜合吸附率和洗脫率結(jié)果，選擇HPD-100型大孔樹脂用于洛龍黨參總皂苷的純化。

表4 不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較

2.3.2 泄露曲線的繪制 由圖5可知，當(dāng)上樣量為6 BV時，泄露的總皂苷濃度為0.21 mg/mL，約達(dá)上樣液濃度的10%，因此選擇上樣體積6 BV。

圖5 泄露曲線

2.3.3 上樣液濃度對吸附效果的影響 由圖6可知，隨著上樣液濃度的增大，樹脂吸附飽和，吸附率逐漸降低，可能因?yàn)樗幰褐杏幸欢ǖ闹苄猿煞?，?dāng)濃度過高時，會堵塞樹脂柱，從而影響吸附效果。但樣品濃度過低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，洛龍黨參總皂苷的上樣液濃度采用5.00 mg/mL為宜。

圖6 上樣液濃度對吸附率的影響

2.3.4 洗脫劑濃度對洗脫效果的影響 由圖7可知，乙醇濃度在50%～70%時與洗脫率呈正相關(guān)，70%乙醇濃度時洗脫率最高，因此選用70%的乙醇溶液作為洗脫劑。

圖7 乙醇濃度對洗脫率的影響

2.3.5 洛龍黨參總皂苷純化驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述所得的最佳純化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可得總皂苷的洗脫率分別為80.91%、85.96%、82.68%，純度分別為88.21%、93.72%、90.14%，平均純度為90.69%，結(jié)果表明該條件下純化洛龍黨參總皂苷的重復(fù)性好，該方法穩(wěn)定可靠。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到乙醇回流提取洛龍黨參總皂苷的最佳提取工藝條件為：提取溫度70℃，料液比1∶25，乙醇濃度70%，提取時間90 min，并在此基礎(chǔ)上，通過比較D101、AB-8、HPD-100、SA-1型4種大孔樹脂的吸附性能，篩選出HPD-100型大孔吸附樹脂作為進(jìn)一步研究的對象，并確立其純化工藝條件為：上樣液濃度5.00 mg/mL，洗脫劑為70%乙醇，純化后樣品的純度為90.69%，該提取純化方法操作步驟簡單，純化效果好，材料經(jīng)濟(jì)，適用于工業(yè)的大批量生產(chǎn)，為洛龍黨參營養(yǎng)物質(zhì)的深度開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。