三種黨參不同炮制品對脾虛模型大鼠腸道菌群的影響

韋 露，馬秀梅，覃樹先，鐘 文，譚雨坪，秦 丹

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200）

黨參是常用的一種補(bǔ)益中藥，別名黃參、防風(fēng)黨參、防黨參等，是多年生草本植物。黨參味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)，具有健脾益肺、補(bǔ)中益氣和養(yǎng)血生津等功效，臨床上常用于脾肺氣虛、食少倦怠、氣血不足、面色萎黃等治療［1，2］。研究表明，以小鼠糞便中的雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌和腸球菌數(shù)量為檢測指標(biāo)，觀察給藥后小鼠腸道菌群的變化，黨參對腸道菌群都有較好的調(diào)節(jié)作用［3］?，F(xiàn)對3種黨參的不同炮制品調(diào)節(jié)脾虛模型大鼠腸道菌群進(jìn)行研究，分析研究黨參哪種炮制品最有利于雙歧桿菌、乳桿菌的增長和繁殖。同時，腸道菌群與中醫(yī)脾虛證也有著密切的聯(lián)系。相關(guān)微生態(tài)學(xué)的研究表明［4］，大鼠腸道內(nèi)的雙歧桿菌和乳桿菌等有益的生理菌數(shù)量與大鼠脾虛癥狀的嚴(yán)重程度成反比，即大鼠脾虛癥狀愈嚴(yán)重，其腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)目越少，由此導(dǎo)致腸道菌群出現(xiàn)紊亂的現(xiàn)象；并且脾臟是人和脊椎動物的內(nèi)臟之一，具有調(diào)節(jié)新陳代謝的作用，中醫(yī)稱“五臟”之一，謂之“后天之本”，脾臟與機(jī)體的各種免疫功能、生理狀況、病理狀況等各個方面都有著密切的關(guān)聯(lián)［5］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 黨參生品（產(chǎn)地：山西，批號190101761），購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院鐘文主任中藥師鑒定，黨參為桔?？浦参稂h參［Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.］、素花黨參［C. pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen］或川黨參（C. tangshenOliv.）的干燥根；大黃為蓼科植物藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根莖。

1.1.2 儀器 D1810C型電子分析天平（上海申生科技有限公司）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠，體重（200±20）g。生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002，動物質(zhì)量合格證號：0001757，實(shí)驗(yàn)動物均由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)鼠分籠飼養(yǎng)于室內(nèi)，濕度（70±5）%，室溫（25±2）℃，動物常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，照明時間隨同自然晝夜變化。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 取黨參生品、米黨參、蜜黨參各300 g粉碎成粗粉，純水浸泡，配制0.40 g/mL的黨參生品、米黨參、蜜黨參混懸液藥品，對造模大鼠進(jìn)行灌胃治療。

將生大黃500 g粉碎，用10倍量水浸泡1 h后，在85℃時煎煮15 min后過濾，靜置后取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下回收純水，即得所需大黃溶液［6］。

1.2.2 大鼠脾虛模型的建立 采用大黃苦寒瀉下法建立大鼠脾虛模型［7］。在第一天稱取大鼠體重后，每只大鼠灌胃100%生大黃制劑3 mL，每天灌胃2次，早上8點(diǎn)1次，晚上6點(diǎn)1次，共9 d。造模成功的表現(xiàn)：大鼠呈現(xiàn)出目光迷離，泄瀉，抱團(tuán)聚集在一起，或者怕冷蜷縮，體重呈現(xiàn)下降趨勢，大鼠的毛發(fā)黃干枯，精神不振奮，活動量明顯減少，手足癱瘓，軟弱無力，瞇眼的狀態(tài)。

1.2.3 動物分組及處理 對50只大鼠進(jìn)行隨機(jī)的分組，分成5組，分別為正常對照組、模型組、黨參生品組、米黨參組、蜜黨參組，每組10只。其中黨參生品組、米黨參組、蜜黨參組大鼠分別給予黨參生品混懸液、米黨參混懸液和蜜黨參混懸液，灌胃給藥，大鼠灌胃時，按照1 mL/100 g體質(zhì)量進(jìn)行；正常組、模型組大鼠則給予等量的蒸餾水，每天1次，共14 d。

1.2.4 體質(zhì)量變化情況的觀察 測定并記錄給藥前后每組大鼠的體質(zhì)量，均于灌胃前稱量。

1.2.5 腸道菌群觀察方法

1）革蘭氏染色觀察。收集大鼠用藥前、用藥后的糞便，取部分涂片，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察并且記錄給藥前后大鼠腸道菌群發(fā)生何種變化。

2）細(xì)菌分離培養(yǎng)。經(jīng)14 d給藥治療后，于第15天對5組大鼠進(jìn)行麻醉，嚴(yán)格按照無菌操作解剖動物，靜脈取血后處死，5組大鼠每組挑6只，用一次性接種環(huán)挑取回盲腸部內(nèi)容物（再取下各個臟器），分別接種于4種培養(yǎng)基。雙歧桿菌培養(yǎng)基（BS）37℃培養(yǎng)48 h，乳桿菌培養(yǎng)基（LBS）37℃培養(yǎng)48 h，大腸桿菌培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h［8］，葡萄球菌培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h［9］，根據(jù)菌落的不同特點(diǎn)進(jìn)行分類，對每種細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)、革蘭氏染色，進(jìn)行分離鑒別。

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，正態(tài)性數(shù)據(jù)則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；組間兩兩比較時，方差齊性采用LSD-t方法檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell方法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 體征觀察

第二天，造模大鼠出現(xiàn)腹瀉、大便溏稀、食欲不振、納少腹脹、扎堆畏寒等脾虛癥狀，并且在后續(xù)造模進(jìn)行過程中，脾虛癥狀呈現(xiàn)逐步加重趨勢。造模結(jié)束后，對大鼠進(jìn)行灌胃，正常組的大鼠正?；顒?；模型組的大鼠仍然呈現(xiàn)脾虛癥狀，倦怠懶動，進(jìn)食量少等；米黨參組的大鼠在服用米黨參混懸液后，脾虛癥狀有所減輕，進(jìn)食量增加，體重增加，頗有精神，與黨參生品組、蜜黨參組的大鼠相比較，米黨參組大鼠脾虛癥狀恢復(fù)較好。

2.2 大鼠給藥前后體重的變化情況

從表1可以看出，與正常組相比，大鼠脾虛模型試驗(yàn)組大鼠體重均顯著下降（P＜0.05），表明大鼠脾虛模型造模成功。給藥后，與模型組比較，3種黨參不同炮制品組和正常組比較，3種黨參不同炮制品實(shí)驗(yàn)組大鼠體重均顯著增加（P＜0.05），表明黨參不同炮制品能改善大鼠脾虛癥狀。

表1 大鼠給藥前后體重變化情況（x±s，n=10）

2.3 黨參不同炮制品對大鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌的影響

從表2可以看出，與正常組相比，大鼠脾虛模型試驗(yàn)組大鼠體內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌顯著下降（P＜0.05），表明大鼠脾虛模型造模成功。給藥后，與模型組比較，3種黨參不同炮制品組和正常組比較，3種黨參不同炮制品試驗(yàn)組大鼠體內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌顯著增加（P＜0.05），表明黨參不同炮制品能改善大鼠脾虛癥狀。

表2 黨參不同炮制品對大鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量的影響 （單位：lg cfu/g）

2.4 黨參不同炮制品對大鼠腸道中葡萄球菌、大腸桿菌的影響

從表3可以看出，與正常組相比，大鼠脾虛模型試驗(yàn)組大鼠體內(nèi)葡萄球菌和大腸桿菌顯著增加（P＜0.05），表明大鼠脾虛模型造模成功。給藥后，與模型組比較，3種黨參不同炮制品組和正常組比較，黨參不同炮制品試驗(yàn)組大鼠體內(nèi)葡萄球菌和大腸桿菌顯著降低（P＜0.05），表明黨參不同炮制品能改善大鼠脾虛癥狀。

表3 黨參不同炮制品對大鼠腸道中葡萄球菌、大腸桿菌數(shù)量的影響（單位：lg cfu/g）

3 小結(jié)與討論

大黃屬瀉下藥，歸脾、胃、大腸、心、肝經(jīng)等［10，11］。長時間以及過量的服用此類藥物，會損傷脾胃，并且耗傷正氣，會產(chǎn)生脾虛癥狀。根據(jù)中醫(yī)理論以及國內(nèi)很多學(xué)者的動物脾虛模型建立方法經(jīng)驗(yàn)，對大鼠灌以大量的大黃水煎液會導(dǎo)致大鼠脾虛，從而引起大鼠腸道內(nèi)的菌群紊亂［12］。

相關(guān)結(jié)果證實(shí)黨參對腸道菌群都有較好的調(diào)節(jié)作用，對雙歧桿菌、乳酸菌的繁殖具有一定的促進(jìn)作用［3］。通過3種黨參不同炮制品的混懸液對脾虛大鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌這兩種菌的數(shù)量會增多，并且后者使兩種細(xì)菌增加的數(shù)量要比前者多；大鼠腸道內(nèi)大腸桿菌、葡萄球菌數(shù)量會減少，恢復(fù)到大鼠體內(nèi)腸道菌群的正常數(shù)量，甚至這兩種細(xì)菌數(shù)量會稍微有所下降。黨參不同炮制品的混懸液確實(shí)對脾虛證有治療作用，并且觀察腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量變化，可知米黨參炮制品對于脾虛證的療效更好。

黨參內(nèi)酯類是重要健脾藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，揮發(fā)油類是燥性成分，黨參多糖呈現(xiàn)一定的調(diào)節(jié)免疫作用［13］。而黨參作為整體在動物機(jī)體發(fā)揮作用過程中，3類成分之間的相互作用尚未論及，其作用靶點(diǎn)、作用機(jī)制等更待探究。黨參作為補(bǔ)氣要藥，為常用的治療及保健藥材，產(chǎn)量大、資源豐富、藥用價值高、市場需求大、臨床上應(yīng)用廣泛。