新型冠狀病毒肺炎疫情前后急性呼吸道感染兒童支原體、衣原體和常見(jiàn)病毒譜分析

羅小娟 蔡德豐 任振敏 劉永秋 劉 景 黃麗蘭 劉小蘭 曹 科 陳運(yùn)生

急性呼吸道感染(ARTI)是 5 歲以下兒童的主要死因之一。早期明確病原，有助于臨床采取針對(duì)性治療，減少抗生素不合理應(yīng)用[1]。然而，ARTI病原復(fù)雜多樣，不同病原所致臨床表現(xiàn)缺乏特異性，且不同地域和氣候特征條件下ARTI病原可能存在不同的流行特征，加上病毒易變異和新型病毒的出現(xiàn)，導(dǎo)致ARTI的病因診斷較為困難[2-4]。深圳市具有亞熱帶季風(fēng)氣候特點(diǎn)，也是中國(guó)最大的移民城市，ARTI病原學(xué)可能具有獨(dú)特的流行特征。此外，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)流行暴發(fā)以來(lái)，ARTI的病原流行特征和病原譜可能發(fā)生了重要變化。本研究旨在了解深圳市兒童常見(jiàn)呼吸道病原體的感染情況和流行特征，并比較 COVID-19疫情前后病原譜的變化，為本地區(qū)ARTI的臨床診治及防控提供參考。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 2019年9月2日至2021年2月28日深圳市兒童醫(yī)院(我院)因臨床診斷ARTI(診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5])住院首次采集并送檢的咽拭子標(biāo)本、年齡29 d至18歲的患兒。

需要說(shuō)明的是，同一患兒多次因ARTI住院的，每次入院首次采集的咽拭子標(biāo)本均納入分析。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①根據(jù)入院臨床診斷，排除先天性遺傳病、免疫缺陷病、惡性腫瘤等；②排除本次住院期間接受了放化療或免疫抑制劑治療。

1.3 分組考慮 ①以2020年3月至2021年2月的數(shù)據(jù)進(jìn)行不同季節(jié)的ARTI病原譜比較，春季為3～5月，夏季為～8月，秋季為～11月，冬季為12月至次年2月。②按患兒年齡分為29 d至6月組、～1歲組、～3歲組、～6歲組、～18歲組。③以2019年9月2日至2020年1月24日的數(shù)據(jù)作為COVID-19疫情前組、2020年9月2日至2021年1月24日的數(shù)據(jù)作為疫情后組。

1.4 咽拭子樣本采集 患兒在入院當(dāng)天采集咽拭子。由我院經(jīng)過(guò)護(hù)理部統(tǒng)一培訓(xùn)并考核合格的護(hù)士，使用專(zhuān)用的植絨拭子(意大利科潘恩股份公司，國(guó)械注進(jìn)20172410211)，左手用壓舌板壓住患兒舌頭，右手將拭子伸至咽峽處，適度用力擦拭咽后壁或懸雍垂的后側(cè)和兩側(cè)扁桃體部位并旋轉(zhuǎn)拭子3圈以增加接觸面，避免接觸舌和口腔黏膜等處，取樣后迅速將拭子放入裝有3 mL細(xì)胞保存液(寧波海爾施基因科技有限公司，浙甬食藥監(jiān)械生產(chǎn)備20150063號(hào))的采樣管中，靠近采樣管頂端處折斷拭子并棄去尾部，旋緊管蓋，2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，保存于-20℃冰箱，24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.5 病原學(xué)檢測(cè) 采用核酸提取試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司，浙甬械備20150246號(hào))和13種呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司，浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20130074號(hào))，經(jīng)全自動(dòng)核酸提取儀Smart LabAssist-32磁珠法提取病原體總核酸。通過(guò)多重PCR與毛細(xì)電泳聯(lián)用技術(shù)，用針對(duì)13種常見(jiàn)呼吸道病原體核酸序列特異區(qū)域的熒光標(biāo)記引物，在1個(gè)擴(kuò)增管中進(jìn)行多重反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物在3500 Dx自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)電泳，經(jīng)Gene Mapper(ABI Prism)分析擴(kuò)增片段的大小和峰高，得到相應(yīng)病原體的檢測(cè)結(jié)果。嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。試劑盒帶有RT-PCR內(nèi)參，可對(duì)樣本核酸提取、RT-PCR和毛細(xì)管電泳進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控。通過(guò)對(duì)RNA和DNA中的人類(lèi)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行樣品質(zhì)量監(jiān)控，如PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)電泳可見(jiàn)人RNA、DNA內(nèi)參峰，說(shuō)明采樣質(zhì)量合格。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(13種病原體檢測(cè)靶點(diǎn)和人RNA、DNA的重組質(zhì)粒)和陰性(人基因組溶液)對(duì)照。

13種常見(jiàn)呼吸道病原體檢測(cè)項(xiàng)目包括：甲型流感病毒(IVA，含H7N9、H1N1、H3N2、H5N2)、季節(jié)性H3N2病毒、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒(IVB，含Victoria株和Yamagata株)、副流感病毒(HPIV，含1型、2型、3型和4型)、呼吸道合胞病毒(RSV，含A組和B組)、腺病毒(HADV，含B組、C組和E組)、鼻病毒(HRV)、偏肺病毒(HMPV)、冠狀病毒(HCOV，含229E、OC43、NL63和HKU1)、博卡病毒(Boca)、肺炎支原體(MP)和衣原體(Ch，含沙眼衣原體和肺炎衣原體)。

同時(shí)檢出≥2種病原體為混合感染。

1.6 資料截取 由1名檢驗(yàn)技師和1名臨床醫(yī)師分別從我院檢驗(yàn)信息系統(tǒng)(LIS)和管理信息系統(tǒng)(HIS)中以月為單位導(dǎo)出患兒姓名、性別、年齡、臨床診斷、采樣時(shí)間和病原體檢測(cè)結(jié)果，由第3人復(fù)核2個(gè)系統(tǒng)導(dǎo)出數(shù)據(jù)的一致性，如有月份數(shù)據(jù)不一致，則重新導(dǎo)出并再次核對(duì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，病原體檢出率等計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間我院共12 734例因臨床診斷ARTI而送檢的咽拭子樣本，其中新生兒89份，先天性遺傳病、免疫缺陷病、惡性腫瘤患兒271例，接受放化療或免疫抑制劑治療156例，ARTI患兒在住院期間非首次采樣的咽拭子標(biāo)本196例。最終12 022例咽拭子標(biāo)本進(jìn)入本文分析，男7 226例，女4 796例，年齡29 d至17歲11月齡，平均(2.8±3.0)歲。

2.2 13種ARTI病原檢出情況 12 022例ARTI住院患兒病原體陽(yáng)性7 589例(63.13%)，檢出率由高到低依次是：HRV 24.83%(2 985例)、 RSV 14.12%(1 698例)、HPIV 8.33%(1 001例)、HMPV 7.01%(843例)、MP 5.37%(645例)、HADV 4.26%(512例)、Boca 2.94%(353例)、HCOV 2.70%(325例)、IVA 2.33%(280例)、H3N2 1.50%(180例)、Ch 0.93%(112例)、H1N1 0.47%(56例)、IVB 0.18%(22例)。

混合感染1 329例(11.05%)，其中同時(shí)檢出2種病原體陽(yáng)性1 238例(10.29%)、2種病原體陽(yáng)性88例(0.74%)、4種病原體陽(yáng)性3例(0.02%)，以HRV+MP最常見(jiàn)，具體見(jiàn)表1。

表1 1 329例混合感染的ARTI患兒咽拭子標(biāo)本的病原體分布

2.3 不同季節(jié)的ARTI病原譜比較 2020年3月至2021年2月共 8 357例ARTI患兒咽拭子標(biāo)本進(jìn)入分析，不同季節(jié)的檢出率由高到低依次為：秋季66.94%(1 924/2 874)、冬季66.44%(2 029/3 054)、夏季56.88%(918/1 614)、春季16.20%(132/815)。春、夏、秋、冬季混合感染檢出率分別為0.74%(6例)、3.41%(55例)、8.18%(235例)和2.39%(73例)。IVA在春季和夏季各檢出1例，IVB僅在夏季檢出1例，H1N1和H3N2在全年均未檢出，圖1顯示，其余9種病原體在不同季節(jié)的檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。春季檢出率最高的病原體為HRV和MP，夏季和秋季均為RSV和HRV，冬季為HRV和HMPV。

2.4 不同性別、不同年齡ARTI患兒的病原譜比較 男患兒病原體檢出率為63.58%(4 594/7 226)，女患兒為62.41%(2 993/4 796)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.69，P=0.19)。 RSV和Boca在男患兒中檢出率分別為15.00%和3.31%，明顯高于女患兒的12.80%和2.38%(χ2=11.49，P<0.001；χ2=8.76，P<0.001)，HMPV在女患兒中的檢出率(7.86%)明顯高于男患兒的6.45%(χ2=8.81，P<0.001)。

圖1 不同季節(jié)ARTI病原體檢出率比較

29 d至6月組、～1歲組、～3歲組、～6歲組和～18歲組病原體檢出率分別為60.11% (1 269/2 111)、66.31% (1 104/1 665)、67.73% (2 485/3 669)、68.20% (2 003/2 937)、41.65% (683/1 640)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1 036.88，P<0.05)；混合感染檢出率分別為11.32%(239例)、8.59%(143例)、12.24%(449例)、13.55%(398例)和6.16%(101例)。圖2顯示，隨年齡增長(zhǎng)，RSV和HPIV檢出率呈明顯下降趨勢(shì)，MP檢出率呈上升趨勢(shì)。除HCOV、H1N1和IVB外，其他10種病原體在不同年齡患兒中的檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同年齡ARTI患兒的病原體檢出情況

2.5 COVID-19疫情前后同時(shí)段病原譜比較 圖3顯示，COVID-19疫情前病原體檢出率為78.57%(2 592/3 299)，由高到低依次為HRV(36.37%)、MP(15.40%)、RSV(10.03%)、HADV(9.03%)等，混合感染764例(23.16%)。疫情后同期病原體檢出率為65.89%(3 500/5 312)，由高到低依次為HRV(23.78%)、RSV(14.74%)、HMPV(12.65%)、HPIV(12.12%)等，混合感染459例(8.64%)。COVID-19疫情前后同期比較，除HCOV以外，其余12種病原體的檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 COVID-19疫情前后同時(shí)段病原譜比較

3 討論

病原學(xué)診斷是ARTI診治的關(guān)鍵，然而，據(jù)報(bào)道25%～60%病例難以明確病原[6]。針對(duì)ARTI常見(jiàn)呼吸道病原進(jìn)行多重、聯(lián)合和高通量檢測(cè)，對(duì)早期明確病原體及合理用藥具有積極意義。本研究采用多重PCR與毛細(xì)電泳聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)ARTI住院患兒咽拭子標(biāo)本中13種常見(jiàn)的呼吸道感染病原體，結(jié)果顯示，深圳地區(qū)ARTI住院患兒ARTI病原以HRV、RSV、HPIV、HMPV、MP和HADV最常見(jiàn)，與2015年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》[7]報(bào)道的兒童肺炎病原體(按檢出率高低依次為：RSV、HRV、HMPV、HADV、MP、HPIV)結(jié)果相似，與國(guó)內(nèi)研究[8-13]報(bào)道的ARTI病原譜存在一定差異，可能與檢測(cè)時(shí)間和地域不同、檢測(cè)方法和納入檢測(cè)的病原體種類(lèi)不同，以及納入研究對(duì)象存在差異(門(mén)診或住院病例、年齡、呼吸道感染部位)有關(guān)。

本研究中深圳市兒童ARTI的病原特征如下：①總體檢出率較高(63.13%)，2019年秋季檢出率達(dá)80.87%，高于文獻(xiàn)[8，11～14]中ARTI患兒病原體檢出率(10.64%～60.35%) ，低于文獻(xiàn)[9,10]下呼吸道感染住院患兒病原體檢出率(分別為78.7%和80.1%)，可能與這2篇文獻(xiàn)中檢測(cè)的病原體種類(lèi)較多(分別為18和22種)有關(guān)。此外，相比傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)方法和血清免疫學(xué)抗體檢測(cè)，多重PCR技術(shù)敏感度、特異度、通量高，覆蓋廣，效率高，對(duì)ARTI病原診斷和混合感染的檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)。②存在明顯的季節(jié)和年齡分布特點(diǎn)，冬、春季是呼吸道感染的高發(fā)季節(jié)，但本地區(qū)ARTI病原體檢出率卻為秋季最高(67.01%)，春季最低(16.20%)，且2020年3月至2012年2月僅檢出2例(2/8 357)IVA，未檢出H1N1和H3N2，與上年度(2019年9月至2020年2月)檢出IVA 278例(7.59%)、H1N1 56例(1.53%)、H3N2 180例(4.92%)比較，這些病原體檢出率呈急劇下降。北京地區(qū)董靜肖等[15]對(duì)門(mén)診發(fā)熱伴呼吸道癥狀患兒的病原分析同樣顯示，IVA檢出率在COVID-19爆發(fā)流行后顯著下降。一方面，可能與IVA的自然流行趨勢(shì)和病毒變異有關(guān)。另一方面，可能與2020年初爆發(fā)COVID-19，患兒減少到醫(yī)院就診以及人群普遍采取嚴(yán)格的防控措施有關(guān)。本研究中夏、秋季檢出率以RSV為首，HRV次之；冬季HMPV檢出率最高；春季以HRV、MP檢出為主，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道[16,17]不同，可能與深圳市夏季高溫多雨、冬季陰冷潮濕的亞熱帶季風(fēng)氣候有關(guān)。

本研究中6月至6歲患兒病原體檢出率均高于總體人群。隨著年齡增長(zhǎng)，RSV和HPIV檢出率明顯下降，MP檢出率明顯升高，與國(guó)內(nèi)其他研究[18,19]報(bào)道一致。雖然隨著年齡增長(zhǎng)，病毒檢出率有所下降，但HRV和HMPV在>6歲兒童中檢出率仍較高，應(yīng)引起重視。

混合感染較多見(jiàn)，同時(shí)檢出≥2種病原體1 329例(11.05%)，以HRV+MP、HRV+RSV、HRV+HPIV常見(jiàn)。HRV是小RNA病毒科腸道病毒屬，在無(wú)明顯呼吸道感染癥狀的兒童中檢出率明顯高于RSV和HADV，單獨(dú)感染時(shí)癥狀輕微，不增加兒童住院風(fēng)險(xiǎn)[20]，提示其是條件致病微生物，在原發(fā)性感染導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降時(shí)易繼發(fā)感染。因此，混合感染是存在條件致病微生物的定植還是感染，需綜合判斷。有研究表明，RSV合并其他病原感染可加重病情并增加治療難度，可能與免疫炎癥反應(yīng)的正反饋效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放增加，加重小氣道黏膜充血水腫，使分泌物增加，進(jìn)而導(dǎo)致氣道狹窄和氧交換障礙有關(guān)[21]。

本研究顯示COVID-19疫情后ARTI住院患兒病原體總體檢出率和混合感染率較疫情前同期明顯下降，提示采取佩戴口罩、減少人員聚集、做好個(gè)人防護(hù)等防疫措施，以及全民公共衛(wèi)生素養(yǎng)提高，可有效降低ARTI疾病傳播和流行。疫情前后ARTI病原譜發(fā)生明顯改變，疫情前組以HRV、MP、RSV、HADV和IVA為主。疫情后組以HRV、RSV、HMPV、HPIV和Boca為主。COVID-19流行期間ARTI病原流行特征變化包括：①M(fèi)P和IVA檢出率顯著減少；②往年秋冬季高發(fā)的RSV感染提前在7～10月出現(xiàn)；③新型病毒如HMPV和Boca檢出率增加。相關(guān)研究表明，HMPV和Boca感染臨床癥狀明顯，可導(dǎo)致支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎，也可引起重癥肺炎，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中檢出率為4.1%～11.5%[22]，提示人類(lèi)感染性疾病愈發(fā)復(fù)雜，防控工作任重道遠(yuǎn)。

本研究局限性：①研究對(duì)象為ARTI住院患兒，未納入門(mén)診輕癥患兒；②檢測(cè)病原體為13種呼吸道感染常見(jiàn)的病毒和非典型病原體，未檢測(cè)其他引起呼吸道感染的病原體，如肺炎鏈球菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌等細(xì)菌，真菌，寄生蟲(chóng)，對(duì)新發(fā)未知病原體和罕見(jiàn)病原體亦無(wú)法檢出。