蒙藥紹沙-7味丸防治大鼠心肌缺血/再灌注損傷的作用*

楊向君， 王 羽， E.巴雅日瑪， 趙 明， S.賀希格扎日嘎拉

(1. 蒙古國(guó)國(guó)立醫(yī)科大學(xué)國(guó)際蒙醫(yī)學(xué)院, 烏蘭巴托999097-15160， 蒙古； 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院, 通遼 028002， 中國(guó)； 3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 通遼 028000， 中國(guó)； 4. 蒙古國(guó)國(guó)立醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院， 烏蘭巴托999097-15160， 蒙古)

缺血性心臟病，特別是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是導(dǎo)致心力衰竭和致死的重要原因之一[1]。其表現(xiàn)包括發(fā)熱、持久的胸骨后劇烈疼痛、心肌相關(guān)的壞死標(biāo)記物表達(dá)增多、患者心電圖發(fā)生改變，具有發(fā)病率高、死亡率高等特點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在急性心肌梗死(AMI)的治療中，早期再灌注是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，但大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，再灌注會(huì)進(jìn)一步損傷心肌。目前，冠脈再灌注雖然快速緩解急性心肌梗死病人的癥狀，但是對(duì)于心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制理解還不夠徹底，仍缺少有效治療心肌缺血/再灌注損傷的方法。如何降低I/R損傷所帶來(lái)的負(fù)性作用，目前已成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

機(jī)制研究比較多的包括氧化應(yīng)激。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)出現(xiàn)過(guò)多現(xiàn)象時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力會(huì)出現(xiàn)下降。而當(dāng)心肌發(fā)生缺血/再灌注的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS。過(guò)多的ROS進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死或凋亡[2-4]。已證實(shí),心肌缺血/再灌注時(shí)會(huì)導(dǎo)致心臟進(jìn)一步惡化，其中包括心律失常、心功能下降等，其機(jī)制可能主要涉及氧自由基損傷[5]。

缺血/再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，其中炎性反應(yīng)也會(huì)發(fā)揮一定的作用[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在缺血/再灌注損傷時(shí)表達(dá)會(huì)突然增加，而采取一定的手段減少心肌炎癥因子的釋放后，心肌細(xì)胞的損傷出現(xiàn)減輕現(xiàn)象[7]。

紹沙七味丸出自《經(jīng)驗(yàn)方》，記載于《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)·蒙醫(yī)學(xué)》，被內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院一直廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐治療心肌梗塞，蒙醫(yī)臨床上療效較好的常用方劑，深受蒙醫(yī)專(zhuān)家們的推崇。紹沙七味丸對(duì)心肌梗塞作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，建立心肌梗死動(dòng)物模型后采用紹沙七味丸進(jìn)行干預(yù)并探索其相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

70只體重(280±20)g雄性SD大鼠，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXKs(吉)2011-0004。麻醉藥品氨基甲酸乙酯購(gòu)買(mǎi)自天津百倫斯生物技術(shù)有限公司。蒙藥紹沙-7味丸為內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司。血清肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸激酶(CK-MB)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、血清乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒購(gòu)置于天津碧云天公司。5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)獲取于Solarbio公司。NF-кB來(lái)自Cell Signaling公司。光學(xué)顯微鏡( Olympus)。

1.2 動(dòng)物分組與給藥

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(2 ml/100 g蒸餾水灌胃，1次/日)、蒙藥紹沙-7味丸低劑量組(0.4 g/kg劑量的蒙藥紹沙-7味丸混懸液灌胃，1次/日)、蒙藥紹沙-7味丸中劑量組(0.8 g/kg劑量的蒙藥紹沙-7味丸混懸液灌胃，1次/日)、蒙藥紹沙-7味丸高劑量組(1.6 g/kg劑量的蒙藥紹沙-7味丸混懸液灌胃，1次/日)、陽(yáng)性對(duì)照組(0.3 g/kg劑量的復(fù)方丹參片混懸液灌胃灌胃，1次/日)，每組10只。飼養(yǎng)條件為室溫(22±1)℃、濕度(45%～55%)的環(huán)境，一天陽(yáng)光照射12 h左右。連續(xù)灌胃15 d后，模型組、紹沙-7味丸(低、中、高劑量組)、陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠進(jìn)行造模，造模前進(jìn)行心電圖檢測(cè)，心電圖異常的大鼠剔除。腹腔內(nèi)注射濃度30 g/L戊巴比妥鈉將大鼠(1.5 ml/kg)麻醉。實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉成功后、固定后記錄心電圖，將大鼠頸部、胸部皮膚剃毛，并進(jìn)行消毒。將頸部正中切開(kāi)皮膚后暴露大鼠的氣管部分，橫向破開(kāi)氣管2～3 mm，然后插管連接ALC-V型動(dòng)物呼吸機(jī)，并對(duì)其行機(jī)械輔助通氣。潮氣量設(shè)定為7.5 ml/kg，頻率設(shè)定為70～80次/分，呼∶吸=5∶4。剪開(kāi)左側(cè)胸部皮膚后，沿左側(cè)3-4肋間打開(kāi)胸腔，開(kāi)胸并牽拉胸壁，心包膜剪開(kāi)暴露心底部，找到冠狀動(dòng)脈左前降支，取5.0帶縫合針線在此處穿線并打活結(jié)阻斷前降支血流。結(jié)扎后，迅速將心臟送回胸腔并關(guān)閉。阻斷冠狀動(dòng)脈左前降支血流30 min后，解開(kāi)活結(jié)恢復(fù)冠脈左前降支血流后再灌注120 min。

1.3 大鼠心肌的病理觀察

大鼠心肌缺血/再灌注120 min后，將大鼠處死并在無(wú)菌狀態(tài)下打開(kāi)大鼠左肋，去除心包后，取出心臟，將心臟的左心室肌組織放入直接切片后置于含2% TTC的0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.4)中，進(jìn)行TTC染色；取心臟左心室部分放入到含4% 多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，處理后，進(jìn)行HE染色，在光鏡下進(jìn)行觀察病理變化。

1.4 ELISA法檢測(cè)大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、SOD、GSH-Px及TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β的水平

取血清復(fù)溫后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、SOD、GSH-Px及TNF-P、IL-18、IL-6、IL-18的水平。

1.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠心室肌組織中的NF-кB蛋白水平

左心室肌組織進(jìn)行切片后，將其放入含4%多聚甲醛溶液中固定，切片處理后，脫蠟水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活后，正常1%BSA山羊血清封閉液，室溫下孵育30 min以封閉，洗去封閉液，加稀釋的一抗。切片放于濕盒中，4C孵育過(guò)夜，將切片置于PBS中浸泡沖洗3次，每次2 min。擦干切片后，添加二抗。室溫下孵育1 h。PBS洗3次，每次2 min，將DAB濃縮液稀釋?zhuān)谇衅臉?biāo)本處滴加50 μl的顯色液，馬上置于顯微鏡下觀察，看到有棕黃色的顆粒出現(xiàn)后馬上將切片置于自來(lái)水中終止反應(yīng)。最后蘇木素復(fù)染、分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蒙藥紹沙-7味丸對(duì)I/R損傷大鼠心電圖的影響

結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后大鼠心電圖變化，R波消失，ST段弓背抬高，而解開(kāi)結(jié)扎線行再灌注后，ST段回落并出現(xiàn)明顯再灌注心律失常現(xiàn)象，而提前灌胃給予蒙藥紹沙-7味丸和陽(yáng)性藥緩解大鼠再灌注后的心律失常(圖1)。

2.2 蒙藥紹沙-7味丸對(duì)I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響

比較假手術(shù)組大鼠的心臟(0%±0%)，I/R損傷大鼠(54.74% ±4.05%)的心肌梗死面積明顯變大，差異顯著；而提前灌胃給予不同劑量蒙藥紹沙-7味丸(低44.38% ±4.14%；中36.27% ±6.02%；高27.72% ±5.97%)和陽(yáng)性藥(15.05% ±3.61%)的大鼠心肌梗死面積顯著縮小，具有劑量依賴(lài)性(圖2)。

Fig. 1 Changes of electrocardiogram in rats of different groups

Fig. 2 Comparison of the infarct area between the different groups

2.3 蒙藥紹沙-7味丸對(duì)I/R損傷大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

與假手術(shù)組大鼠比較，I/R損傷大鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)水腫，而提前灌胃給予蒙藥紹沙-7味丸和陽(yáng)性藥的大鼠心臟心肌纖維紊亂，水腫現(xiàn)象有所緩解(圖3)。

Fig. 3 Histopathological changes of myocardium in rats of each group under light microscopy

2.4 蒙藥紹沙-7味丸對(duì)I/R損傷大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、SOD、GSH-PX水平的影響

與假手術(shù)組比較，I/R損傷大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯增加、SOD顯著減少，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽(yáng)性藥組大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯減少、SOD顯著增加(表1)。

2.5 蒙藥紹沙-7味丸對(duì)I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β水平的影響

與假手術(shù)組比較，I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯增加，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽(yáng)性藥組大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯減少(表2)。

Tab. 1 The contents of cTnI, CK-MB, LDH, MDA, GSH-PX and SOD in different groups n=10)

Tab. 2 The contents of TNF-α, IL-18, IL-6 and IL-1β in different groups (pg/ml, n=10)

2.6 蒙藥紹沙-7味丸對(duì)I/R損傷大鼠心臟組織NF-кF蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較，I/R損傷大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達(dá)增高；與模型組相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組和陽(yáng)性藥組大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達(dá)減少(圖4)。

3 討論

心血管疾病是全球造成死亡的最主要原因，由于人口的快速增長(zhǎng)預(yù)計(jì)在2002年至2030年，年均每百萬(wàn)人口因心血管疾病的死亡率將從16.7人增加到23.3人。急性心肌梗死(acute myocardial Infarction，AMI)是因?yàn)楣跔顒?dòng)脈的急性閉塞引起的冠脈血流急劇減少或中斷，導(dǎo)致部分的心肌因嚴(yán)重長(zhǎng)時(shí)間的缺血出現(xiàn)局部壞死，而這些壞死的心肌被纖維化瘢痕組織代替，失去了原有的收縮功能，逐步發(fā)展為心律失常、休克或心力衰竭，嚴(yán)重可致死亡。近年來(lái)，治療AMI的方法包括動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓療法等手段，這些方法的建立和推廣應(yīng)用，使得AMI缺血心臟能在短時(shí)間內(nèi)重新獲得血液灌注并恢復(fù)氧供應(yīng)。早期開(kāi)通閉塞的冠脈，迅速恢復(fù)冠脈血流可以減少心肌壞死范圍，保護(hù)并挽救缺血心肌，改善預(yù)后，降低病死率。但大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，再灌注會(huì)進(jìn)一步損傷心肌，目前AMI引起的心肌損傷被公認(rèn)為是心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。目前，冠脈再灌注雖然快速緩解AMI病人的癥狀，但是對(duì)于I/R損傷的機(jī)制理解還不夠徹底，仍缺少有效治療心肌缺血再灌注損傷的方法。傳統(tǒng)蒙醫(yī)學(xué)并無(wú)急性心肌梗死(AMI)病名。根據(jù)其病因病機(jī)、癥狀體征蒙醫(yī)認(rèn)為AMI是吉如很哈特拉嘎(粘盛)范疇。主要癥狀為心慌氣短，心前區(qū)灼熱，胸痛徹背，心痛如刀割，重者暈厥。蒙藥紹沙-7味丸出自《經(jīng)驗(yàn)方》，記載于《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)·蒙醫(yī)學(xué)》，被內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院一直廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，蒙醫(yī)臨床上療效較好的常用方劑，深受蒙醫(yī)專(zhuān)家們的推崇。由廣棗、丁香、沉香、肉豆蔻、廣木香、阿魏和兔心配合組成。具有抑心赫依、安神定志、增強(qiáng)心功能之功效，主治胸痛、心赫依、心悸、心衰、氣喘等病癥[8]。方中以行氣活血，養(yǎng)心，鎮(zhèn)靜作用的廣棗為主，安神寧心作用的野牛心為輔，配以沉香以祛心赫依熱，丁香以抑主脈赫依，肉豆蔻、阿魏抑心赫依，廣木香以調(diào)理體素，平氣血不和，止痛為佐使[9]。諸藥共奏，有行氣止痛，活血化瘀之功效。蒙醫(yī)針對(duì)該病的治療采用辨證施治，強(qiáng)心鎮(zhèn)痛，促進(jìn)清濁分化，改善全身赫依血運(yùn)行，活血化瘀，舒暢血脈之瘀滯，通過(guò)調(diào)理整體以調(diào)節(jié)三根失衡，使患者的機(jī)體赫依血功能紊亂、清不消化得到糾正，進(jìn)而控制了本病的進(jìn)一步發(fā)展[10]。本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量的蒙藥紹沙-7味丸提前灌胃給予大鼠后，再建立心肌梗塞模型，發(fā)現(xiàn)蒙藥紹沙-7味丸改善心肌缺血再灌注大鼠心律失?，F(xiàn)象，減少梗死面積及降低心肌組織的損傷。說(shuō)明蒙藥紹沙-7味丸可有效緩解I/R損傷。

I/R損傷的機(jī)制涉及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、鈣超載、能量代謝障礙等多種學(xué)說(shuō)，其中氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[11]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS的含量過(guò)多的時(shí)候，氧化應(yīng)激產(chǎn)生，I/R損傷的整個(gè)過(guò)程都伴隨著氧化應(yīng)激。已證實(shí),心肌缺血/再灌注將引起心臟發(fā)生病理性改變包括心功能減低，心律失常等，這些心臟的病理改變都與氧化應(yīng)激相關(guān)[5]。結(jié)果表明，I/R損傷大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯增加、SOD顯著減少，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽(yáng)性藥組大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯減少、SOD顯著增加。心肌IR機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)同樣起著關(guān)鍵的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯增加，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽(yáng)性藥組大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯減少。炎癥相關(guān)蛋白NF-κB作為快速反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，與多種心血管疾病密切相關(guān)，其中就包括動(dòng)脈粥樣硬化[12]。抑制NF-κB蛋白的活化在一定程度上可以抑制炎癥進(jìn)而緩解心肌病。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，I/R損傷大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達(dá)增高；與模型組相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組和陽(yáng)性藥組大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達(dá)減少。表明蒙藥紹沙-7味丸緩解I/R損傷與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)。

綜上，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證明了蒙藥紹沙-7味丸在一定劑量范圍內(nèi)可以緩解大鼠I/R損傷，其機(jī)制與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)。