維生素D水平對(duì)初診2型糖尿病患者腸道菌群的影響

符蘭芳， 蒙緒標(biāo)， 張菊云， 林 珠， 黃辛欣

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南省?？谑?570206)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)近年來在全球范圍內(nèi)呈井噴式發(fā)展，是全球最主要的一類非傳染性慢性疾病，基于國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(international diabetes federation,IDF)最新調(diào)研顯示，世界上DM病人數(shù)量為4.63億左右，中國(guó)DM病人在世界DM病人總量中的占比達(dá)1/3，2型糖尿病的占比則超過了九成[1-2]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一類慢性代謝性疾病，主要由外周組織胰島素抵抗或胰島β細(xì)胞分泌功能不足引起，以慢性高血糖為特征，與腸道菌群密切相關(guān)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病等多種代謝性疾病患者體內(nèi)血清維生素D(vitamin D,VitD)水平有不同程度的下降[4]。因此，有研究人員提出，在體內(nèi)血糖代謝維持正?；顒?dòng)方面，VitD可能起著關(guān)鍵性影響，能夠使胰島素敏感性増強(qiáng)，有效改善胰島素抵抗[5]。而在T2DM患者中，VitD含量與腸道菌群平衡是否存在相關(guān)性呢？本研究通過分析初診2型糖尿病患者中不同維生素D水平對(duì)糖脂代謝及腸道菌群的分布狀態(tài)，探討VitD含量影響T2DM病人腸道菌群狀況及相關(guān)的潛在機(jī)制，為糖尿病防治提供新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為本院2018年6月—2019年6月期間165名未行降糖干預(yù)的初診T2DM病人，根據(jù)維生素D情況分為維生素D充足組80例(25-(OH)D>30 μg/L)和維生素D不足或缺乏組85例(25-(OH)D<30 μg/L)，同時(shí)將110位健康者歸入對(duì)照組。此次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意，研究對(duì)象皆知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):未接受降糖治療的初診2型糖尿病。糖尿病的診斷參考1999年WHO制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①有皮質(zhì)醇增多癥和甲狀腺功能異常病史者;②肝腎功能異常者;③嚴(yán)重感染DM急性并發(fā)癥人員;④2周內(nèi)服用利尿劑、β-受體阻滯劑、激素等影響糖代謝和脂代謝的藥物者；⑤2周內(nèi)應(yīng)用抗生素等；⑥最近6個(gè)月內(nèi)曾發(fā)生過急性心腦血管事件、結(jié)締組織病、腫瘤和風(fēng)濕性心臟病者；⑦妊娠期糖尿病、1型糖尿病、基因缺陷引起的胰島β細(xì)胞功能障礙、成人隱匿性自身免疫性糖尿病等特殊類型糖尿病患者；⑧胃腸道慢性炎癥患者。

1.3 研究方法

測(cè)量研究對(duì)象身高、體質(zhì)量、腰圍。禁食10 h后，第二天早上采血，測(cè)定總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)和胰島素(insulin，INS)的含量。留取患者的糞便標(biāo)本100 mg進(jìn)行腸道細(xì)菌DNA的提取和分析。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

血漿葡萄糖測(cè)定方法為葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)法；采用美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)的BeOkmanDXC800型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定患者空腹TC和TG含量；采用電化學(xué)發(fā)光法(西門子試劑盒分別購(gòu)自西門子公司)測(cè)定患者的胰島素含量。IR指數(shù)通過穩(wěn)態(tài)模型(homeostasis model assessmen，HOMA)進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體為HOMA-IR=FPG×FINS(空腹胰島素)/22.5。

患者大便標(biāo)本的處理和DNA提取如下：采集患者100 mg糞便，利用Qiagen Genomic DNA提取試劑盒(QIAGEN,Hilden,Germany)，提取和純化15 ng DNA用以測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。采用Illumina Nextera XT測(cè)序系統(tǒng)對(duì)16 sRNA基因V3V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增、建立文庫(kù)。樣本庫(kù)用Index后，進(jìn)行混合(Pooling)和Miseq測(cè)序(PE300)。借助Miseq測(cè)序所得PE reads參照條形碼來區(qū)分各樣本，完成序列質(zhì)量的質(zhì)控與過濾處理,根據(jù)重疊關(guān)系進(jìn)行拼接,完成拼接所得序列的質(zhì)控與過濾處理，獲得優(yōu)化序列。對(duì)優(yōu)化序列實(shí)施OTU聚類以及物種分類學(xué)這2項(xiàng)分析，參考OTU聚類分析結(jié)果，能夠分析各類多樣性指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組基線資料比較

通過比較各組患者的基線數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)各組間年齡與性別差異無顯著性(P>0.05)，VitD不足或缺乏組BMI、腰圍顯著高于VitD充足組和對(duì)照組，VitD充足組高于對(duì)照組(P<0.05；表1)。

表1 各組基線資料比較

2.2 各組血脂、血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

組間TC、TG差異無顯著性(P>0.05)，VitD充足組，VitD缺乏或不足組FPG、FINS和HOMA-IR均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，VitD缺乏或不足組高于VitD充足組(P<0.05；表2)。

表2 各組患者血脂、血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

2.3 物種多樣性比較

通過Alpha多樣性來分析單個(gè)樣品物種多樣性，涉及observed species、shannon、chao、ace與simpson這5個(gè)指數(shù)。前4個(gè)指數(shù)愈大，第5個(gè)指數(shù)愈小，表明樣品所含物種愈具多樣性。VitD不足或缺乏組和VitD充足組患者腸道菌群的物種多樣性均較對(duì)照組明顯下降，且VitD不足或缺乏組比VitD充足組更明顯(P<0.05；圖1)。

圖1 患者Alpha多樣性比較

2.4 物種及其豐度的比較

門水平分析患者腸道菌群變化，建立門水平的分類柱狀圖(圖2和圖3)。腸道菌群分屬12個(gè)門，每例觀察對(duì)象的腸道菌群構(gòu)成皆以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門為主，占總體菌群的95%以上。就腸道菌群內(nèi)變形菌與擬桿菌的相對(duì)豐度而言，相較VitD缺乏或不足組，VitD充足組呈顯著增多表現(xiàn)，但在放線菌與厚壁菌的相對(duì)豐度上，后者有所下降。

圖2 患者腸道菌群在門水平的豐度比較

圖3 患者腸道菌群結(jié)構(gòu)組分圖(門水平)

3 討 論

VitD屬于一類類固醇衍生物，由人體皮膚合成或從食物中提取。主要活性形式為25-羥維生素D和1，25-二羥維生素D，其中前者為體內(nèi)VitD最主要的儲(chǔ)存方式。維生素D在維持人體鈣、磷平衡方面起著基礎(chǔ)性的作用。然而，伴隨這些年VitD研究深度的加大，不斷有新的證據(jù)顯示，VitD同時(shí)具備廣泛的其他生理活性[6-8]，尤其是在胰島素合成與分泌，還有外周功能方面發(fā)揮一定作用。VitD能夠上調(diào)細(xì)胞外Ca+水平，對(duì)胰腺β細(xì)胞合成具誘導(dǎo)性，同時(shí)可生成CBP(鈣結(jié)合蛋白)，由此快速上調(diào)胰腺β細(xì)胞Ca+水平，增強(qiáng)胰島素分泌，也可直接作用于胰島β細(xì)胞或與其結(jié)合的相關(guān)受體，促進(jìn)胰島素的轉(zhuǎn)錄和合成。因此，維生素D缺乏或不足會(huì)干擾胰島素的合成、釋放和減低組織細(xì)胞敏感性，是糖尿病的內(nèi)在致病因素。

本研究結(jié)果表明：VitD缺乏或不足組腰圍、BMI顯著升高，3組間TC、TG差異無顯著性；HOMA-IR、FPG、FINS較對(duì)照組顯著升高，且VitD不足或缺乏組高于VitD充足組，表明維生素D缺乏或不足，可提高IR以及使代謝紊亂加劇。相較VitD充足組，VitD缺乏或不足組患者FINS分泌增加，與既往研究認(rèn)為維生素D不足或缺乏可以抑制胰島素合成分泌不符，考慮研究對(duì)象為初診糖尿病，此期以胰島素分泌增多及抵抗為主，如果是糖尿病中期或者晚期，VitD不足或缺乏可能會(huì)出現(xiàn)胰島素分泌明顯減少。

VitD在平衡鈣磷代謝與影響胰島素合成的同時(shí)，也參與調(diào)節(jié)腸道微生物的組成。前期研究發(fā)現(xiàn)維生素D或VitDR缺乏會(huì)導(dǎo)致生態(tài)失衡，腸道更容易破壞[9]。本研究中，每例研究對(duì)象的腸道菌群構(gòu)成皆以厚壁菌門、變形菌門與擬桿菌門為主，占總菌群的95%以上，同時(shí)伴有不同程度的物種多樣性水平降低。與VitD不足或缺乏組相比，在腸道菌群內(nèi)變形菌與擬桿菌的相對(duì)豐度方面，VitD充足組呈顯著偏高表現(xiàn)，但在放線菌與厚壁菌的相對(duì)豐度上，后者有所下降。本研究中VitD不足或缺乏組的厚壁菌豐度比VitD充足組增多，擬桿菌豐度比比VitD充足組減少，提示VitD不足或缺乏可能通過改變腸道菌群分布而對(duì)宿主能量代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而引起宿主的糖脂代謝紊亂，甚至誘發(fā)和加重糖尿病。因此，對(duì)于T2DM的形成和發(fā)展而言，VitD的早期適度補(bǔ)充可能使其有所改善。

總之，VitD不足或缺乏，可使患者胰島素抵抗(IR)加劇，破壞了腸道菌群平衡，降低了腸道物種的豐度和多樣性。未來需要進(jìn)一步研究維生素D調(diào)節(jié)腸道菌群的具體機(jī)制，以及探討維生素不足或缺乏的2型糖尿病人群早期補(bǔ)充維生素D的臨床意義。