藏、漢族EPAS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化的差異研究*

李小薇 肖軍 雷慧芬 白曉瑩 孟方園 李翠瑩

我國高原面積約占國土面積1/4，因低壓低氧、干燥寒冷等不僅限制其發(fā)展，而且嚴重威脅進入高原環(huán)境工作及旅游等人員的身心健康。世居平原人員首次進入高原后會發(fā)生紅細胞（RBC）數(shù)目、血紅蛋白（Hb）濃度增加等生理改變，以改善組織供氧。但是進入高原若產(chǎn)生過多的紅細胞則使血液粘度加大，進一步加重組織缺氧，不利于高原習服。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)EPAS1、EGLN1等低氧誘導因子相關(guān)基因的序列變異在高原低氧適應(yīng)中具有重要作用，且與藏族人相對低Hb濃度密切相關(guān)[1，2]。然而關(guān)于EPAS1基因DNA甲基化、組蛋白乙酰化等表觀遺傳學變化在高原低氧習服與適應(yīng)中的研究較少。因此本研究擬在世居高原藏族、平原漢族及久居高原漢族中比較EPAS1基因DNA甲基化水平的差異，并分析其在高原低氧習服與適應(yīng)的可能作用。

材料與方法

1 樣本來源 抽取世居高原藏族、世居平原漢族及久居高原漢族（＞10年）各10名志愿者抗凝血標本，志愿者全部為19～50周歲健康男性，平原漢族組19～44周歲（平均年齡2 7.8 0±8.0 8），久居高原漢族組24～50周歲（平均年齡33.30±8.11），世居高原藏族21～50周歲（平均年齡31.10±7.84）。所有志愿者均簽署知情同意書，并通過調(diào)查，排除相互之間的親緣關(guān)系。本研究經(jīng)中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心（原空軍總醫(yī)院）倫理委員會批準（第2017-08-YJ02）。

2 試劑和儀器

2.1 試劑：D N A提取試劑盒（Bio TeKe Corpration），DNA染料（BioTeKe Corpration），瓊脂糖（BIOWEST，REGΜLAR （AGAROSE，G-10）），NaHSO3（Zymo），EpiTYPER?Reagent Kit（Agena，Inc），總RNA提取試劑盒（天根生化，北京），Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化，北京），SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）（天根生化，北京）。

2.2 儀器：低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），核酸自動提取儀（Bio TeKe Corpration），分光光度計（Nano Drop 2000，Thermo），凝膠電泳成像儀（Major science），ABI veriti-384 PCR儀（ABI），384-well SpectroCHIP?bioarray芯片（Agena，Inc），Mass ARRAY Nanodispenser 點樣機（Agena，Inc），MassARRAY Analyzer 4.0質(zhì)譜儀（Agena， Inc），普通PCR儀（伯樂T 1 0 0），實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher）。

3 實驗方法

3.1 DNA提?。翰捎肈NA提取試劑盒，取適量抗凝外周血，參照操作說明書提取基因組DNA。通過OD檢測及凝膠電泳檢測DNA濃度及純度；DNA總量：3～5 μg，濃度大于50 ng/μL。

3.2 甲基化引物設(shè)計與合成：通過美國國家生物信息中心（NCBI）獲取EPAS1基因序列（序列號NC_000002），按甲基化常規(guī)設(shè)計方法，截取基因轉(zhuǎn)錄起始位點的上游5 000 bp至下游1 000 bp序列，并預(yù)測CpG島，針對CpG島區(qū)進行方案設(shè)計。確定目的序列輸入到EpiDesigner軟件進行引物設(shè)計。根據(jù)軟件運行結(jié)果，選擇并確定合適的引物序列，合成帶有T7 RNA聚合酶啟動子序列的引物，5'端引物序列-aggaagagagGGGAATTAGATTGATTTTTTTAATTTT G，3'端引物序列-cagtaatacgactcactatagggagaaggctA ACCTCTACCCTAACCCTAACCC。擴增片段大小為600 bp，設(shè)計引物位置距離轉(zhuǎn)錄起始點-783 bp～-183 bp。

3.3 NaHSO3處理待檢測DNA樣品：使用3.6M亞硫酸鹽，作用DNA模板1.5 h，將樣本DNA中沒有甲基化的C全部轉(zhuǎn)化為U（相當于DNA中的T）。使用3.2設(shè)計的一對帶有T7啟動子序列的特殊引物擴增樣本，得到帶有T7 RNA聚合酶啟動子序列的600 bp擴增產(chǎn)物。

3.4 Agena MassArray系統(tǒng)進行甲基化檢測：在體外轉(zhuǎn)錄體系中，利用T7 RNA聚合酶，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA片段。在上步操作體系中，利用RNase A能夠特異性識別并切割RNA中U 3'端的特性，將RNA片段切割成攜帶有CpG位點的小片段。使用Agena MassArray?飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測產(chǎn)物，檢測結(jié)果使用MassArray EpiTYPER? 1.3軟件（Agena，Inc）獲取原始數(shù)據(jù)和圓點圖，根據(jù)含G峰和含A峰的面積比較，計算出待檢樣本甲基化及非甲基化程度，屬于兩者相對定量比值。檢測步驟包括PCR擴增反應(yīng)，SAP反應(yīng)，T切/RNase A 消化反應(yīng)，樹脂純化，芯片點樣，Massarray分析及數(shù)據(jù)輸出。

3.5 總RNA提取及cDNA合成：采用血液總RNA提取試劑盒，取適量抗凝外周血，參照操作說明書提取總RNA。同時，采用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA合成，所得產(chǎn)物保存在-20℃冰箱。

3.6EPAS1基因mRNA表達引物設(shè)計、合成及qRTPCR擴增：通過美國國家生物信息中心（NCBI）獲取EPAS1基因RNA序列（序列號NC_000002），Primer Premier 5引物設(shè)計軟件設(shè)計EPAS1基因mRNA表達引物，F(xiàn)-5'ACGCCACCCAGTACCAGGA-3'，R-5'AATGAGGGCCCGAGCAGC-3'。采用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒參照試劑說明書檢測不同分組中EPAS1基因mRNA表達量。

4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0進行不同分組人群中EPAS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度的差異分析，符合正態(tài)分布進行獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

本項目選擇E P A S 1基因轉(zhuǎn)錄起始位點G上游783 bp～183 bp啟動子區(qū)域，包含59個CpG位點的甲基化區(qū)域，檢測結(jié)果包含37個CpG位點甲基化程度。運用Agena MassArray核酸質(zhì)譜定量檢測平原漢族、久居高原漢族及高原藏族3組DNA甲基化程度的差異，選擇甲基化程度＞2.5%的10個位點分析發(fā)現(xiàn)平原漢族、久居高原漢族及高原藏族部分CpG位點甲基化程度存在顯著差異（表1）。EPAS1基因啟動子區(qū)整體DNA甲基化程度分別為平原漢族組8.87%±10.31%、久居高原組7.17%±10.12%及高原藏族組9.32%±13.07%，3組人群中均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，圖1）。

圖1 3組人群中EPAS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度

表1 3組人群中EPAS1基因啟動子區(qū)甲基化程度的差異

關(guān)于表觀遺傳學中DNA甲基化的研究普遍認為，基因啟動子區(qū)DNA甲基化發(fā)揮基因表達抑制的作用。本研究分析發(fā)現(xiàn)，久居高原漢族EPAS1基因表達量顯著高于平原漢族，世居高原藏族略高于平原漢族（圖2）。

圖2 3組人群中EPAS1基因表達量的比較久居高原組vs平原漢族組，*P＜0.05

有研究發(fā)現(xiàn)CpG位點甲基化與特定基因序列突變相關(guān)[3]。因此，研究者在3組人群中分析了EPAS1基因rs13419896、rs1868092及rs4953354位點序列突變與DNA甲基化的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個位點序列突變與DNA甲基化程度不存在統(tǒng)計學差異（P＞0.05，圖3）。

圖3 3組人群中EPAS1基因序列突變與啟動子區(qū)DNA甲基化的分析

討 論

隨著基因組學及表觀基因組學的不斷發(fā)展，人們對遺傳學的認識和研究越來越深入，關(guān)于人類發(fā)育及腫瘤等疾病的調(diào)控機制除了包括基因序列變異等遺傳學改變外，還包括DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學的作用。據(jù)報道，DNA甲基化與低氧誘導因子（HIF）共同參與高原低氧轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)低氧反應(yīng)元件（HRE）與HIF-1結(jié)合位點存在多個CpG島，若某些特殊CpG位點發(fā)生甲基化，則會抑制DNA與各類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，提示HIF-1結(jié)合的HRE相關(guān)基因調(diào)控對DNA甲基化水平具有一定的敏感性[5]。近年已有多項研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧誘導因子相關(guān)基因EPAS1、EGLN1等序列變異及mRNA表達與高原適應(yīng)密切相關(guān)，但關(guān)于EPAS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化與高原低氧適應(yīng)的研究較少[1，2]。因此，本研究對比了世居平原漢族、久居高原漢族及世居高原藏族3組中EPAS1基因DNA甲基化水平的差異，并分析EPAS1基因DNA甲基化程度對高原低氧適應(yīng)的作用。

本研究采用Agena MassArray核酸質(zhì)譜定量分析3組人群中EPAS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)世居高原藏族、世居平原漢族及久居高原漢族中僅部分CpG位點甲基化程度存在統(tǒng)計學差異，啟動子區(qū)整體甲基化程度無統(tǒng)計學差異，久居高原漢族低于平原漢族，與已有研究一致。如國外一項研究發(fā)現(xiàn)生活在安第斯山脈的高海拔（4 388米）人群EPAS1基因DNA甲基化水平低于生活在低海拔（0米）地區(qū)的同種人群，且甲基化程度與移居高原的居住年限呈負相關(guān)，因此研究者提出DNA甲基化對于高海拔地區(qū)的適應(yīng)過程發(fā)揮重要作用[6]。

DNA甲基化特征在不同種族人群中存在差異[7]。本研究發(fā)現(xiàn)高原藏族人群的甲基化程度高于其他2組漢族人群，這與國外的研究不一致，但主要原因是國外的研究是在同一人群不同海拔高度。本文中高原藏族與平原漢族屬于不同的人群，可能不同人群本身具有甲基化水平的差異，但是飲食、壓力及運動等環(huán)境因素的作用引起了不一致結(jié)果。正如在埃塞俄比亞適應(yīng)高海拔地區(qū)的遺傳結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，高原藏族特有的與高原適應(yīng)相關(guān)基因序列變異在埃塞俄比亞高原適應(yīng)中無明顯相關(guān)，同時在埃塞俄比亞高海拔與低海拔人群中未發(fā)現(xiàn)HIF相關(guān)基因的DNA甲基化差異[8]。

國內(nèi)一項關(guān)于高原低氧適應(yīng)DNA甲基化譜的研究發(fā)現(xiàn)，世居高原藏族與移居平原藏族之間存在4 2 1個差異甲基化基因，排名前5位的差異甲基化基因包括5-羥色胺受體5B（HTR 5BP）、肌球蛋白1 C（M Y O 1 C）、富含亮氨酸的重復序列3 4（LRRC34）、含有144個家族的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域N末端樣（CCDC144NL）及核糖核酸酶H1假基因1（RNASEH1P1）等；移居高原漢族與平原漢族之間存在55個差異甲基化基因，排名前5的差異甲基化基因包括受體家族11亞家族H成員2（OR11H2）、HBS 1樣翻譯GTP酶（HBS 1L）、嗅覺受體家族4亞家族K成員15（OR4K15）及T細胞受體β常數(shù)2（TRBC2）。國內(nèi)在高海拔及低海拔地區(qū)的藏族與漢族DNA甲基化譜的研究中未展示與低氧誘導因子相關(guān)基因的甲基化差異[9]。

國內(nèi)外研究證實，世代生存在高海拔地區(qū)的人類在適應(yīng)高原缺氧環(huán)境的過程中表觀遺傳因素發(fā)揮了一定作用，但機制仍不清楚[6，8-9]。多項研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于癌癥形成機制中表觀遺傳因素具有重要作用，比如缺氧誘導因子HIF與表觀遺傳機制共同作用，對癌細胞缺氧做出積極反應(yīng)[10-12]；在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，EPAS1基因是高甲基化的[13]。這些研究強調(diào)了DNA甲基化在介導細胞應(yīng)對缺氧反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，這也支持人類可通過表觀遺傳機制適應(yīng)高海拔缺氧環(huán)境的觀點。本研究發(fā)現(xiàn)，久居高原漢族EPAS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平低于平原漢族，而mRNA表達量顯著高于平原漢族，意味著平原漢族進入高原后可能通過DNA甲基化的改變影響EPAS1基因mRNA表達來適應(yīng)高原低氧環(huán)境；而藏族EPAS1基因DNA甲基化水平高于漢族，但mRNA表達量仍高于平原漢族，這與漢族中結(jié)果不一致，藏族世代居住高海拔地區(qū)，其適應(yīng)高原的機理更復雜，DNA甲基化以何種機制參與其中，仍需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)久居高原漢族EPAS1基因DNA甲基化程度低于平原漢族，DNA甲基化程度低可促進EPAS1基因mRNA表達，結(jié)果表明漢族人群移居高原后可通過DNA甲基化的改變影響EPAS1基因表達以適應(yīng)高原缺氧環(huán)境。高原藏族EPAS1基因DNA甲基化程度高于平原漢族及久居高原漢族，這與EPAS1基因mRNA表達水平不一致，可能跟不同人群及環(huán)境因素有關(guān)系，通過其他未知途徑參與高原適應(yīng)。根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)，下一步可進行同一人群不同海拔高度全基因組DNA甲基化研究，這些基因和通路在高原缺氧適應(yīng)過程中可能會發(fā)生DNA甲基化變化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突