低氧誘導(dǎo)因子HIF-2α調(diào)控紅細(xì)胞生成的研究進(jìn)展*

高瞻 肖軍 李小薇 李翠瑩

短時間暴露于低氧時，機(jī)體紅細(xì)胞和血紅蛋白水平會快速升高以改善組織供養(yǎng)，而長期處于低氧環(huán)境是導(dǎo)致繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的重要原因。從生理角度來看，胚胎所處的子宮和成人骨髓都是相對低氧的造血環(huán)境，因此從病理到生理、嬰兒到成年，低氧和紅細(xì)胞生成都密不可分。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIFs）是感受和調(diào)控細(xì)胞氧水平的中樞調(diào)節(jié)因子。HIFs最早由SEMENZA從Hep3B細(xì)胞中純化，認(rèn)為其誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素（EPO）和其他氧敏感基因表達(dá)[1]，隨后RATCLIFFE和KAELIN證實(shí)HIFs α亞基內(nèi)特定脯氨酸殘基的羥基化是控制其活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[2]，奠定了研究動物細(xì)胞氧感應(yīng)的分子基礎(chǔ)。HIFs與造血的關(guān)系一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，目前認(rèn)為HIF-1α是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）代謝的主要因子，其通過影響HSCs糖酵解、線粒體呼吸和氧化應(yīng)激調(diào)控細(xì)胞自我更新和分化，而越來越多的研究表明HIF-2α在調(diào)控紅細(xì)胞生成方面功能更加突出，這不僅源于其最重要的靶基因-EPO是紅細(xì)胞成熟的關(guān)鍵因子，也因其對造血器官正常發(fā)育以及機(jī)體鐵代謝平衡維持具有重要意義，本文就此進(jìn)行梳理和闡述，旨在為防治紅細(xì)胞增多癥、貧血等疾病提供新的思路。

1 HIF-2α結(jié)構(gòu)及低氧應(yīng)答通路 HIF-2α又稱內(nèi)皮PAS區(qū)域1蛋白（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1），屬于堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）Per-ARNT-Sim（PAS）轉(zhuǎn)錄因子家族，HIF-2α N端含PAS和bHLH序列，參與HIF-2α與HIF-1β之間的異二聚體化反應(yīng)，此外bHLH結(jié)構(gòu)域還介導(dǎo)缺氧反應(yīng)元件（HREs）與靶基因啟動子或增強(qiáng)子的共有序列（G/ACGTG）結(jié)合。HIF-2α有兩個轉(zhuǎn)錄激活域（TAD）：C末端激活域（C‐TAD）和N末端激活域（N‐TAD），兩者與轉(zhuǎn)錄輔助因子如CBP/p300相互作用，前者促進(jìn)HIF‐1α和HIF‐2α共同靶基因的表達(dá)，后者促進(jìn)HIF‐2α特異性靶基因表達(dá)，而與N‐TAD重疊的氧依賴性降解區(qū)（ODD）調(diào)控HIF-2α結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[3]。

常氧條件下，HIF-2α ODD區(qū)的兩個保守脯氨酸殘基（Pro-405、Pro-531）被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化，使HIF-2α與腫瘤抑制因子（VHL）結(jié)合，后者招募E3泛素酶連接復(fù)合物最終使HIF-2α多泛素化降解，半衰期約5分鐘[4]。此外，常氧下HIF-2α C-TAD結(jié)構(gòu)域中的天冬酰胺殘基Asn-847被HIF抑制因子（FIH）羥基化，抑制HIF-2α與CBP/p300的相互作用。PHD和FIH都是鐵和α酮戊二酸依賴的雙加氧酶，缺氧時兩者活性下降，導(dǎo)致HIF-2α的羥基化受抑制，此時穩(wěn)定的HIF-2α進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β形成二聚體，結(jié)合低氧反應(yīng)元件（HREs）調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[5]。

2 HIF-2α是胚胎造血的必需因子 胚胎發(fā)育的最早階段實(shí)際上是沒有任何血細(xì)胞的，當(dāng)胚胎成長至一定體積，子宮內(nèi)氧和其他必須的因子無法經(jīng)擴(kuò)散支持胚胎發(fā)育時，胚胎才會開始造血。第一個造血細(xì)胞在卵黃囊中胚層產(chǎn)生，然后出現(xiàn)于尿囊和胎盤，隨后第一批具有成人造血干細(xì)胞（HSCs）功能特性的細(xì)胞在生血內(nèi)皮的主動脈-性腺-中腎（AGM）區(qū)域中產(chǎn)生,它們遷移到胎兒肝臟、胎盤、脾，最終定居于骨髓產(chǎn)生各類血細(xì)胞，整個過程同時進(jìn)行著內(nèi)皮細(xì)胞的不斷分化以及血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

HIF-2α的靶基因包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（Flt）、一氧化氮合酶（NOS）等，對胚胎期造血階段胚胎發(fā)育及血管形成具有關(guān)鍵的作用。早期研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α缺陷小鼠發(fā)生出血，卵黃囊內(nèi)血管無法保持分離的結(jié)構(gòu)或組裝成更大的血管并在胚胎發(fā)育期E9.5和E13.5之間死亡[6],而在HIF-2α敲除胚胎的血管內(nèi)皮中表達(dá)HIF-2α cDNA可挽救血管發(fā)育并提高胚胎存活率，表明HIF-2α對胚胎發(fā)育期血管形成中起重要作用，是血管網(wǎng)重塑為血管的必要條件。COMPERNOLLE[7]等的研究顯示由于VEGF合成不足，HIF-2α敲除胚胎超過半數(shù)死于心臟衰竭，而幼鼠死于呼吸窘迫綜合征。即使極少數(shù)幼鼠得以存活，也表現(xiàn)出多器官功能障礙，包括心肌肥厚、肝脂肪變性、氧化應(yīng)激增加相關(guān)的視網(wǎng)膜病變以及嚴(yán)重的造血缺陷，提示HIF-2α是胚胎期造血和器官發(fā)育的關(guān)鍵因子。近期有研究以斑馬魚為對象，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α突變個體內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化（EHT）相關(guān)基因Runx1、cMyb表達(dá)下調(diào)，HSCs產(chǎn)生減少，并進(jìn)一步確定Nocth信號在HIFα調(diào)控EHT的下游發(fā)揮作用，揭示了HIF-2α調(diào)控胚胎造血的機(jī)制[8]。

3 HIF-2α直接或間接調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞狀態(tài) 人胚發(fā)育4個月后骨髓成為造血中心，骨髓的生理解剖結(jié)構(gòu)為HSCs提供固有的低氧環(huán)境。HIFs是參與HSCs低氧應(yīng)答通路的主要因子，HIF-1與HIF-2共同調(diào)控HSCs存活、靜息和分化。Rouault-Pierre K等研究發(fā)現(xiàn)無論是常氧還是低氧，HIF-2α的敲除對于抑制造血祖細(xì)胞（HPCs）分化形成紅系集落較HIF-1α敲除更為顯著，但這可能與shHIF-1α細(xì)胞中HIF-2α水平代償性升高有關(guān)，進(jìn)一步通過異種移植模型發(fā)現(xiàn)shHIF-2α HPCs在小鼠體內(nèi)6周后丟失率（70%）遠(yuǎn)高于shHIF-1α（26%），直到24周前者CD34+CD38-細(xì)胞減少程度都顯著高于后者，表明HIF-2α維持人HPCs長期重建能力[9]。

HIFs的表達(dá)是整個造血微環(huán)境而不是某種單細(xì)胞類型的特征，在這些微環(huán)境中存在的其他因素也能誘導(dǎo)HIFs基因的表達(dá)，因此除了直接調(diào)控，HIF-2α也通過作用于造血微環(huán)境內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞間接調(diào)節(jié)造血干祖細(xì)胞的維持和分化。成骨細(xì)胞是維持造血的主要支持細(xì)胞，研究表明HIF-2α通過受體激活劑配體（RANKL）影響骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并且HIFs的靶向轉(zhuǎn)錄因子Twist2與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（Traf6）參與成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)并維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)[10]。造血微環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞對于支持紅細(xì)胞生成也起重要作用,內(nèi)皮細(xì)胞血管黏附分子-1（VCAM-1）是HIF-2α的直接靶基因，HIF-2α敲除小鼠VCAM-1表達(dá)顯著降低導(dǎo)致正細(xì)胞性貧血，而恢復(fù)VCAM-1表達(dá)可促進(jìn)紅系祖細(xì)胞發(fā)育并挽救該表型[11]。GUARNERIO J等研究證明HIF-2α通過STAT通路促進(jìn)一類表達(dá)干細(xì)胞抗原1（SCA-1）和血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）的骨髓間充質(zhì)祖細(xì)胞（PαS+細(xì)胞）增殖并分泌CXCL10等細(xì)胞因子，維持造血干祖細(xì)胞靜息而抑制其增殖和分化[12]，提示HIF-2α多方面調(diào)節(jié)造血干祖細(xì)胞狀態(tài)。此外，微環(huán)境內(nèi)與HSCs共定位的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）保護(hù)HSCs免受免疫攻擊，近期研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α而非HIF-1α的敲除使Treg細(xì)胞在抑制炎癥方面發(fā)生功能缺陷[13]，初步揭示了HIF-2α對此類細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，為研究其間接調(diào)控造血功能提供了新的視角。

4 HIF-2α調(diào)控EPO表達(dá)的突出功能 EPO對紅細(xì)胞生成至關(guān)重要，其通過促進(jìn)紅系前體細(xì)胞的存活、增殖和分化維持成熟紅細(xì)胞的產(chǎn)生，保障血液的攜氧能力。胚胎中肝臟是EPO產(chǎn)生的主要部位，而成人約90%的循環(huán)EPO來源于腎臟，腎源性和肝源性EPO的產(chǎn)生都與局部組織的氧合狀態(tài)密切相關(guān)。

早期研究使用Cre-loxP重組酶系統(tǒng)敲除小鼠腎組織HIF-2α并確保肝臟和骨髓等器官中HIF-2α介導(dǎo)的缺氧反應(yīng)仍然保持完整，發(fā)現(xiàn)突變小鼠存在紅系造血缺陷，雖然小鼠腎臟HIF-1α及其靶基因表達(dá)升高但腎EPO及血清EPO水平顯著下降，這表明腎臟中EPO的缺氧調(diào)節(jié)幾乎完全依賴Hif-2α而非HIF-1α[14]。近期有研究使用熒光蛋白tdTomato特異性標(biāo)記腎臟內(nèi)產(chǎn)生EPO的細(xì)胞，證明腎髓質(zhì)皮質(zhì)管間質(zhì)細(xì)胞是腎臟唯一產(chǎn)生EPO的細(xì)胞類型，并且此類細(xì)胞所在區(qū)域氧利用率大幅下降是激活EPO合成的關(guān)鍵[15]。盡管正常成人造血過程中，肝臟只合成少量EPO，但在嚴(yán)重缺氧的條件下，肝源性EPO的產(chǎn)生可占循環(huán)EPO的33%以上，相關(guān)研究表明對于不同年齡小鼠HIF-2α都是調(diào)節(jié)肝臟EPO表達(dá)的主要HIF，而肝內(nèi)HIF-2α較HIF-1α優(yōu)先結(jié)合EPO基因HREs是主要原因[16]。

EPO失調(diào)導(dǎo)致貧血或紅細(xì)胞過度增多。MELANIE J PERCY等報(bào)道了一例家族遺傳性紅細(xì)胞增多癥患者PHD2突變導(dǎo)致HIF-2α過表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)EPO造成紅細(xì)胞異常增多[17]。另有研究對比居住于海拔3000-4500米的健康居民和以紅細(xì)胞異常增多為特征的慢性高原病（CMS）患者，發(fā)現(xiàn)CMS患者骨髓細(xì)胞HIF-2α/EPO通路活性顯著增強(qiáng)[18]。臨床上，PHD抑制劑JTZ-951， Roxadustat及當(dāng)歸提取物ASP等都能通過穩(wěn)定HIF-2α結(jié)構(gòu)，提高HIF-2α在細(xì)胞內(nèi)的水平治療EPO生成障礙造成的慢性腎病貧血[19,20]。

5 HIF-2α與機(jī)體鐵代謝的相互作用 紅系前體細(xì)胞對鐵的儲存、利用水平?jīng)Q定著其是否能正常合成血紅蛋白而最終成熟，人每天需要足夠的鐵維持生理造血，而HIF-2α從腸道鐵吸收和鐵調(diào)素水平等方面調(diào)控著鐵穩(wěn)態(tài)。

腸道鐵吸收指十二指腸細(xì)胞表面的細(xì)胞色素b（Cytb）將三價鐵還原為亞鐵，后者通過二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（DMT1）進(jìn)入細(xì)胞，儲存于鐵蛋白或最經(jīng)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FNP）進(jìn)入血液，結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）運(yùn)輸至各個部位。早期研究已證實(shí)DMTI、Tf、FNP以及銅藍(lán)蛋白（CP）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）等的鐵代謝相關(guān)基因是HIF-2α的直接靶基因[21]，從腸上皮的生理特征也可以解釋HIF-2α調(diào)節(jié)腸道鐵吸收的作用：腸上皮下粘膜結(jié)構(gòu)高度血管化，未進(jìn)食時絨毛微血管血流量較小，此時上皮處于相對缺氧的狀態(tài)，十二指腸細(xì)胞局部HIF-2α水平升高，增加鐵吸收相關(guān)基因表達(dá)，以便餐后消化過程增加鐵的攝取。

鐵調(diào)素（hepcidin）是肝臟合成的肽類激素，可直接結(jié)合FPN抑制細(xì)胞排出鐵，進(jìn)而抑制體內(nèi)鐵的循環(huán)。ANDREW J等使用hepcidin/FNP基因敲除小鼠及全基因組RNA序列分析證明了肝臟hepcidin通過限制鐵依賴性PHD酶活性調(diào)控腸道HIF-2α水平[22]。Sheila A等發(fā)現(xiàn)了與之類似的鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP/HIF-2α調(diào)控軸調(diào)節(jié)鐵吸收與紅細(xì)胞生成[23]，進(jìn)一步說明鐵代謝與HIF-2α間關(guān)系是相互且復(fù)雜的。與鐵代謝異常相關(guān)的血液疾病包括缺鐵性貧血、鐮狀細(xì)胞?。⊿CD）以及β地中海貧血等，以HIFs為靶目標(biāo)的PHD抑制類藥物對于缺鐵性貧血的應(yīng)用與腎病貧血類似。SDC和β地中海貧血本質(zhì)都是無效造血，患者肝鐵儲存過載并且鐵吸收率升高，已有研究表明破壞SCD小鼠腸道HIF-2α導(dǎo)致RBC、Hb和HTC升高，小鼠發(fā)生溶血并且紅細(xì)胞存活率顯著下降[24]。β地中海貧血與HIF-2α間的關(guān)系仍不明確，但越來越多的研究表明靶向腸道HIF-2α或是其上游的hepcidin/IRP的藥物在鐵過載相關(guān)血液疾病方面具有重要的治療潛力[25,26]。

6 結(jié)語 從第一個造血細(xì)胞誕生開始，HIF-2α通過作用于局部組織和全身代謝多方面、多層次的調(diào)控著機(jī)體一生的造血，幫助機(jī)體獲得足夠的紅細(xì)胞以適應(yīng)各種生理刺激；HIF-2α及低氧適應(yīng)通路成員（VHL、PHD等）的突變也與遺傳性紅細(xì)胞增多癥、缺鐵性貧血、慢性腎病貧血等病理過程密切相關(guān)，其靶向藥物在多種血液疾病具有廣闊的臨床前景?？傊琀IF-2α調(diào)控造血的重要作用毋庸置疑。另外，近期多項(xiàng)研究報(bào)道了HIF-2α在肺血管病變、血栓形成、肝/腎腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[27-29]，而上述患者的造血功能和血液指標(biāo)都發(fā)生顯著改變，這不僅體現(xiàn)了HIF-2α調(diào)控細(xì)胞功能的廣泛性與復(fù)雜性，也提示我們從更多角度探索HIF-2α在生理病理造血過程中的作用機(jī)制。相信未來將有更多針對HIF-2α及其相關(guān)通路的治療措施不僅幫助我們攻克血液系統(tǒng)疾病，更為癌癥等人類難題帶來答案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突