2014-2017年山西省沙門氏菌分子分型及耐藥性研究

姚素霞，郝瑞娥，王 洋，張秋香，楊紅霞，韓吉婷，秦文彥

沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌。該菌主要通過污染的食物感染人類，引起嘔吐、腹瀉等癥狀[1]。沙門氏菌是全球報道最多、各國公認的食源性疾病所致感染性腹瀉的首要致病菌[2]。目前，抗生素在臨床及畜牧業(yè)中的濫用，出現(xiàn)了大量的沙門氏菌的耐藥菌株。但是不同血清型的沙門氏菌耐藥性會顯著不同，為了解山西省沙門氏菌血清分布與耐藥圖譜，分析耐藥菌株之間的同源性，研究沙門氏菌的耐藥機制，本文對山西省食源性疾病監(jiān)測來源的137株沙門氏菌進行了耐藥性檢測，并對耐喹諾酮類藥物的沙門氏菌進行了耐藥基因與分子分型研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014-2017年山西省食源性病例哨點醫(yī)院分離自患者糞便標本的沙門氏菌共137株。其中，2014年23株，2015年16株，2016年35株，2017年63株。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基由法國CHROMAgar公司生產(chǎn)，腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管由北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)，沙門氏菌診斷血清、Swarm Agar誘導軟瓊脂由丹麥SSI公司生產(chǎn)，革蘭陰性藥敏檢測板由美國Thermo公司生產(chǎn)，Taq DNA 聚合酶由寶生物工程 (大連)有限公司生產(chǎn)，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。Seakem Glod瓊脂糖由美國LONZA公司生產(chǎn)，蛋白酶K由瑞士Roche公司生產(chǎn)，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ由美國New England Biolabs公司生產(chǎn)，GelRed染料由美國Biotium公司生產(chǎn)。所用試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 儀器 藥敏連續(xù)加樣儀由美國Thermo生產(chǎn)，PCR 儀由AB公司生產(chǎn), PFGE系統(tǒng)與凝膠成像系統(tǒng)由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.3 細菌血清型鑒定 137株沙門氏菌根據(jù)《食源性疾病監(jiān)測工作手冊》要求進行生化鑒定，依據(jù) 《WHITE-kauffmann-Le Minor 抗原表》分型來確定血清型。

1.4 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法對分離到的137株沙門氏菌進行MIC值測定，藥物有萘啶酸、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、頭孢噻肟、慶大霉素、頭孢西丁等8種抗生素。結(jié)果根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI2017) 標準進行判斷。

1.5 耐藥基因的測定 耐藥基因序列：gyrAF:5′-ACGTACTAGGCAATGACTGG-3′,gyrAR:5′-AGAAGTCGCCGTCGATAGAA-3′;parCF: 5′-CTATGCGATGTCAGAGCTGG-3′，parCR:5′-TAACAGCAGCTCGGCGTATT-3′。采用煮沸法制備DNA模板，PCR反應體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L的dNTP Mix 2 μL， 耐藥基因上、下游引物 (10 mmol/L) 各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq 酶0.5 μL，去離子水16 μL。 PCR反應條件：98 ℃變性10 s，55 ℃(gyrA基因為15 s，parC為5 s)，72 ℃延伸 60 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增陽性的PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司進行序列雙向測定。所測序列應用 BLAST 軟件將測序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中的標準菌株Salmonella Typhimurium LT2進行同源性分析比對，確定突變點和氨基酸突變類型。

1.6 PFGE分子分型 根據(jù)國家食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡(TraNet)中沙門氏菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)標準分型方法進行規(guī)范操作。PFGE圖像應用Bio Numerics 6.6軟件進行分析。

1.7 質(zhì)量控制 藥敏試驗的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922。PFGE分子分型的質(zhì)量標記選用參考菌株沙門氏菌H9812。

1.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌株情況 137株沙門氏菌79株分離自男性，58株分離自女性，男女比例為1.36∶1；各個年齡段均可感染，中青年組(18～60歲)發(fā)病率最高，共分離菌株67株(48.91%)，其次為嬰幼兒組(0～5歲)，分離菌株37株(27.01%)。137株菌分離自山西省6個市，大同市56株(40.88%)，太原市23株(16.79%)，長治市22株(16.06%)，陽泉市17株(12.41%)，晉中市15株(10.95%)，臨汾市4株(2.92%)。全年均可檢出，高峰期為5～10月，共檢出111株沙門氏菌，占總檢出數(shù)的81.02%。137株沙門氏菌經(jīng)診斷血清凝集后共分為16個血清型，主要為腸炎沙門氏菌51株，鼠傷寒沙門氏菌47株，其他沙門氏菌39株(表1)。

表1 137株沙門氏菌血清分布Tab.1 Serotype distribution of 137 Samonella isolates from patients

2.2 藥敏結(jié)果 本文選取了8種抗生素的藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)137株沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率最高，為56.93%；其次為四環(huán)素，耐藥率為34.31%；對頭孢噻肟、慶大霉素及頭孢西丁的耐藥率較低，分別為8.03%、5.84%及0.73%(表2)。比較不同血清型的沙門氏菌對這8種抗生素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率明顯高于鼠傷寒沙門氏菌，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.401，P<0.05)；鼠傷寒沙門氏菌對環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素的耐藥率高于腸炎沙門氏菌，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為34.489，10.319,19.218，均P<0.05)(表3)；腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌對四環(huán)素的耐藥率差別無統(tǒng)計學意義(χ2= 1.528，P>0.05)，對頭孢噻肟、慶大霉素、頭孢西丁耐藥率都很低。

表2 137株沙門氏菌對8種抗生素的耐藥情況Tab.2 Drug resistance of 137 isolated Samonella strains to eight antibiotics

表3 腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌抗生素藥敏試驗Tab.3 Susceptibility testing of S. enteritidis and S. typhimurium

2.3 喹諾酮耐藥基因的測定 從藥敏結(jié)果中可以看出，沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率最高，因此我們篩選出對萘啶酸耐藥的78株沙門氏菌，進行gyrA基因和parC基因點突變的測定，發(fā)現(xiàn)對萘啶酸耐藥的沙門氏菌gyrA基因與parC基因檢出點突變129個。gyrA基因中最常見突變?yōu)榈?7位氨基酸突變?yōu)锳sp87Tyr(48.72%)，其次為Asp87Asn(14.10%)、Ser83Leu(7.70%)和Ser83Phe(5.13%)。parC基因中只檢出1個突變點，為 Ser80Arg(89.74%)。

2.4 PFGE分型 篩選出對萘啶酸耐藥的51株腸炎沙門氏菌與21株鼠傷寒沙門氏菌，分別進行PFGE分析。51株腸炎沙門氏菌的相似度在70.6%～100%，共得到21種PFGE圖譜，各帶型包含的菌株數(shù)不等，E14包含有10株菌，E17包含9株菌，E19包含7株菌等(圖1)。21株鼠傷寒沙門氏菌的相似度在58.9%～100%，共得到15種PFGE圖譜，各帶型包含的菌株數(shù)不等，同一帶型菌株數(shù)最多的為5株(圖2)。

圖1 萘啶酸耐藥的腸炎沙門氏菌聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of S. enteritidis resistance to nalidixic acid

圖2 萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門氏菌聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of S. typhimurium resistance to nalidixic acid

3 討 論

沙門氏菌血清型眾多,目前我國發(fā)現(xiàn)的血清型達322個[2]。本次研究中,腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門氏菌是山西省人源沙門氏菌感染的優(yōu)勢血清型,分別占 37.23% 與34.31% 。這與我國北京市、河南省等地的報道相似[3-6]，但與廣東、武漢等地的報道有所差別[7-8]，說明沙門氏菌感染型別分布可能存在地域差別。

抗生素的廣泛使用致大量細菌產(chǎn)生了耐藥性，沙門氏菌的耐藥情況也非常嚴重。本研究發(fā)現(xiàn)，山西省分離到的沙門菌對一代喹諾酮類藥物耐藥率最高，達到56.93%，這與文獻報道一致[9]，可能與萘啶酸也在上世紀被廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)有關。四環(huán)素的耐藥現(xiàn)象也較為嚴重，這可能與四環(huán)素類藥物在不同抗生素之間的交叉耐藥明顯[10]，以及多西環(huán)素和米諾環(huán)素在臨床的廣泛應用有關，也可能與四環(huán)素在養(yǎng)豬業(yè)的廣泛使用，耐藥菌株通過豬肉傳播給人類有關[11]。環(huán)丙沙星作為治療沙門氏菌感染的一線藥物，耐藥率為 14.60%，但它的中敏率達到了33.58%，這可能與臨床中濫用和不規(guī)則治療關系密切[12]。作者又分別比較腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌對8種抗菌藥物的耐藥率，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌對萘啶酸的耐藥率比鼠傷寒沙門菌高,差異有統(tǒng)計學意義，但鼠傷寒沙門氏菌對環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、慶大霉素的耐藥率均高于腸炎沙門氏菌，差異有統(tǒng)計學意義，這可能與不同型別的沙門氏菌耐藥機制不同有關。沙門氏菌耐藥現(xiàn)象嚴重,今后需加強臨床用藥的科學性和嚴謹性,減少耐藥菌的發(fā)生，防止耐藥菌株的流行。

喹諾酮類藥物通過抑制DNA拓撲異構(gòu)酶而阻止DNA拓撲異構(gòu)酶變化，妨礙細菌DNA復制、轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控從而達到抑菌和殺菌的目的[13]。在本研究中，對萘啶酸耐藥的沙門氏菌gyrA基因與parC基因檢出突變點129個。gyrA基因中最常見突變?yōu)榈?7位氨基酸突變?yōu)锳sp87Tyr(48.72%)；parC基因中只檢出1個突變點，為Ser80Arg(89.74%)。這些突變可能就是導致耐藥產(chǎn)生的主要原因[14-15]，但同時我們發(fā)現(xiàn)并不是所有耐喹諾酮的沙門氏菌都有基因突變的發(fā)生，沙門氏菌對萘啶酸的耐藥是一個復雜的機制，更多的機制還有待進一步深入的研究。

PFGE具有分辨能力高，重復性好等優(yōu)點，是目前細菌分子分型的金標準，它是采用稀有限制性內(nèi)切酶對細菌進行酶切，通過比對各個酶切條帶之間的差別，從整個基因組上來反映菌株之間的關系[16]。本研究采用XbaⅠ酶切,共得到21種PFGE圖譜，各帶型包含的菌株數(shù)不等，51株腸炎沙門氏菌的相似度在70.6%～100%。除2014年的E1、E2、E3型別外，其余型別的相似度達81.6%，說明這些沙門氏菌緊密相關，特別是包含菌株較多的帶型如E14、E17、E19、E11之間的相似度達90%以上，說明我省腸炎沙門氏菌可能存在相對集中的親緣關系。21株鼠傷寒沙門氏菌PFGE分為15個型別，相似度在58.9%～100%，除2017年長治市發(fā)生的一次聚集性事件外，鼠傷寒沙門氏菌其它型別之間差異明顯,表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性,說明鼠傷寒沙門氏菌具有廣泛的來源。