浙江省人源豬鏈球菌鑒定及毒力基因檢測分析

朱水榮，張 政，姚蘋蘋，楊 勇，方 磊，張嚴峻

豬鏈球菌(Streptococcussuis，Ss)是一種人獸共患病原菌。該菌是1987年由Kilpper-Balz發(fā)現(xiàn)的一個新種[1-2]，早期按照莢膜抗原的差異分為35個血清型(1～34型，1/2型)[3]，2005年，Hill等[4]從基因水平證實其中的32及34型為鼠口腔鏈球菌(StreptococcusofisraRi), 豬鏈球菌被分為33個血清型(1～31型，1/2型和33型)。近年來，基于16S rRNA以及其它保守性較高的看家基因的序列分析，血清型20、22、26、33又被排除豬鏈球菌家族[5]，這次豬鏈球菌被分為29個血清型(1～19型，21型，23～25型，27～31型和1/2型)。目前已知，能感染人的致病血清型主要包括1/2、1、2、7、9和14型6種類型[6-11]，其中以2型豬鏈球菌 (Streptococcussuistype 2，SS2)致病力最強。2型豬鏈球菌具有很強的侵襲能力，并產(chǎn)生致病性很強的外毒素，引起感染者發(fā)生嚴重的不可逆的休克及DIC，最后發(fā)生多器官功能衰竭而死亡[12]。1968年，丹麥首次報道豬鏈球菌感染導致人腦膜炎的病例[13]。其后，在亞洲、美洲、歐洲、大洋洲等地區(qū)均有人感染豬鏈球菌病例報道，累計感染人數(shù)已超過1 600人[14]。豬鏈球菌的致病機理雖然現(xiàn)在還不是很清楚,但研究表明和其毒力因子有密切的相關(guān)性[15-18]。以往學者們主要針對Cps、mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh、gapdh等毒力相關(guān)基因進行檢測[19-21]，最近報道[22]有ciaHR、dltA、endoB、lgA1、manN、neuB、Permease、pgdA、purD、rgg、salKR、dpeIV、serum、sortase、sspA、sum_61等多個毒力相關(guān)基因可被檢測到，本文參考文獻[22-24]中毒力基因相關(guān)引物序列，對歷年來收集的浙江省散發(fā)豬鏈球菌感染者分離株進行了PCR檢測，以了解毒力基因群分布情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 28株實驗用豬鏈球菌菌株均為2005-2020年浙江省各地疾病預防控制中心分離上送，分別來自臺州(6株)、嘉興(6株)、寧波(3株)、紹興(3株)、溫州(3株)、衢州(2株)、金華(2株)、杭州(1株)、湖州(1株)、麗水(1株)10個地區(qū)，病例無集中，非共同暴露，無二代病例及人-人之間的傳播，均為歷年來浙江省散發(fā)豬鏈球菌感染者分離株。實驗對照株大腸埃希菌ATCC 8739標準菌株作為質(zhì)譜儀鑒定菌株對照用。

1.2 菌株鑒定 所有菌株均采用法國生物梅里埃VITEK 2 Compact高級專家系統(tǒng)及其質(zhì)譜儀BIOM系統(tǒng)及其質(zhì)譜儀pVITEK MS V2.3.3系統(tǒng)進行菌種鑒定檢測，用豬鏈球菌分型血清(SSI，丹麥)作血清學玻片凝集試驗，以鑒定血清型。另參考文獻[24-26]對鏈球菌屬特異性tuf基因、豬鏈球菌種特異性16SrRNA基因與血清型2型Cps2J、7型Cps7H及9型Cps9D鑒別檢定基因分別進行PCR檢測，以期相互佐證實驗鑒定結(jié)果，PCR引物見表1。

1.3 菌株DNA提取 挑取SS2單個菌落轉(zhuǎn)種血平板，5% CO237 ℃培養(yǎng)18～24 h，無菌棉簽刮取適量，置于裝有1 mL滅菌生理鹽水的EP管中，上下?lián)u勻，熱裂解儀70 ℃10 min后，高速離心去上清，接下來使用QIAamp DNA Mini kit(50)DNA提取試劑盒，按說明書步驟提取豬鏈球菌DNA基因組，提好的DNA置于4 ℃冰箱以供PCR用。

1.4 主要試劑與儀器

1.4.1 PCR試劑與反應條件 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM version 2.0 plus dye)RR901；PrimeSTARTMHS DNA Ploymerase[Prime STARTMHS DNA Ploymerase、5loymeraseRTMHS DNA P(Mg2+plus)、dNTP Mixture]；DNA Marker DL 2 000/100 bp DNA Ladder Marker均購自寶生物工程TaKaRa(大連)有限公司,反應條件與方法參照試劑說明書。

1.4.2 儀器 法國生物梅里埃VITEK 2 Compact高級專家系統(tǒng)(Systems版本05.01)；法國生物梅里埃質(zhì)譜儀 BIOM物梅里埃質(zhì)譜儀act000/100 bp DNA；美國Thermo公司的二氧化碳培養(yǎng)箱；德國Eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR；英國TECHNE DRI-Block DB·2D裂解儀；德國Eppendorf AG22331 Hamburg離心機；美國MiniRun GEL Electrophoresis System BIOER凝膠電泳儀；美國FR-200A全自動紫外可見分析裝置。

1.5 引物與合成 參考文獻[22-26]合成鏈球菌屬tuf基因、豬鏈球菌種16SrRNA基因、血清型鑒定基因Cps2J(兼莢膜毒力基因)、Cps7H及Cps9D以及毒力基因mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh、gapdh、ciaHR、dltA、endoB、lgA1、manN、neuB、Permease、pgdA、purD、rgg、salKR、dpeIV、serum、sortase、sspA、sum_61等引物，所有引物及探針序列交由TAKARA公司/上海生工公司合成，測序交由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司。PCR擴增條件、退火溫度及片段大小均參考相關(guān)文獻執(zhí)行，少數(shù)引物PCR反應條件需要重新調(diào)整，見表1。

表1 PCR擴增引物Tab.1 Primers for PCR amplification

1.6 PCR產(chǎn)物檢測 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時用DNA Marker DL 2 000/100 bp DNA Ladder Marker電泳以作對照。電泳產(chǎn)物用FR-200A型全自動紫外與可見分析裝置獲取圖像。

1.7 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 所有菌株均進行16S rRNA全基因測序，測序結(jié)果應用DNAMAN軟件進行序列拼接比對，對齊序列利用Mega 7.0軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 生化及血清學 取在羊血瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)20 h的菌落，涂片革蘭染色鏡檢，結(jié)果均為長鏈或短鏈革蘭陽性球菌。取適量純培養(yǎng)菌落用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行生化鑒定，均為豬鏈球菌，檢測可信值均在95%～99.9%。挑取單個菌落分別與豬鏈球菌分型血清逐個作血清學玻片凝集試驗，同時以滅菌生理鹽水作對照，所有菌株均與2型豬鏈球菌標準血清發(fā)生凝集，經(jīng)鑒定所有菌株均為血清型2型。

2.2 質(zhì)譜儀鑒定 以無菌槍頭蘸取單個新鮮菌落均勻涂布于VITEK MS靶板的圓孔中央，再加上1 μL基質(zhì)溶液，晾干后上機檢測。全部菌株經(jīng)VITEK MS V2.3.3實施基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS) 技術(shù)鑒定檢測，同時以標準大腸菌ATCC 8739作為質(zhì)控對照菌株，28株菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定均為豬鏈球菌。

2.3 屬、種及型PCR檢測 抽提所有菌株DNA，經(jīng)PCR擴增檢測，結(jié)果為鏈球菌屬特異性tuf基因、豬鏈球菌種特異性16SrRNA基因以及血清型2型Cps2J基因(兼莢膜多糖毒力基因)均出現(xiàn)相應大小片段，而對照血清型7型Cps7H及對照血清型9型Cps9D兩基因均未有對應條帶擴增出。圖1為ZJ-6號菌株屬、種、型及11種毒力基因PCR檢測電泳結(jié)果，圖2為ZJ-6號菌株另外13種毒力基因PCR檢測電泳結(jié)果。

M:100 bp DNA Ladder Marker圖1 ZJ-6菌株屬、種、型及11種毒力基因PCR結(jié)果Fig.1 Genus, species, serotype and 11 virulence genes of the ZJ-6 strain, determined by PCR analysis

M:100 bp DNA Ladder Marker圖2 ZJ-6菌株13種毒力基因PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of 13 virulence genes of the ZJ-6 strain

2.4 毒力因子PCR檢測 28株菌株經(jīng)PCR檢測，其中Cps2J、mrp、orf2、fbps、gdh、gapdh、ciaHR、dltA、lgA1、manN、neuB、pgdA、purD、dpeIV、serum、sortase及sspA共17種毒力基因均被檢出預期目的大小陽性條帶，檢出率為100%；除1株ZJ-31未檢測出epf、sly、endoB、Permease、rgg及sum_61 6種毒力基因目標條帶，其它菌株均檢測出相應這些毒力基因目標條帶，檢出率均為96.43%(27/28)；15株菌株(ZJ-8、ZJ-9、ZJ-10、ZJ-18、ZJ-19、ZJ-22、ZJ-23、ZJ-24、ZJ-25、ZJ-26、ZJ-29、ZJ-30、ZJ-31、ZJ-33及ZJ-34)未檢出salKR毒力基因目標條帶，該毒力基因檢出率最低，僅為46.43%(13/28)。圖3為28株SS2菌株24種毒力基因檢測率豎狀圖結(jié)果。

圖3 28株菌株24種毒力基因的檢出率Fig.3 Detection rate of virulence genes among the 28 strains

2.5 遺傳進化 應用Mega 7.0軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹，樹狀圖結(jié)果顯示除了1株來自2018年的ZJ-31菌株單獨在另一分枝外，其它菌株同源性極高，進化相同均在同一分枝，見圖4。

圖4 28株菌株16S rRNA基因測序樹狀圖Fig.4 Tree map of the 28 strains, determined by 16S rRNA gene sequencing

3 討 論

豬鏈球菌感染呈世界性分布。近年來，基于16SrRNA以及其它保守性較高的看家基因的序列分析，血清型20、22、26、32、33以及34血清型均被排出豬鏈球菌家族[5]，同時也有新的血清型被發(fā)現(xiàn)[27]，可見豬鏈球菌血清學分型的復雜性。豬鏈球菌血清型分布有著明顯的地域特征，在北美血清型2型及3型是較為常見的血清型，而在歐洲血清型9型卻是流行血清型[14,28]，亞洲的泰國、越南及中國臺灣、香港等大多流行株為血清型2型[29-34]。目前，在所有血清型中，2型豬鏈球菌仍是毒力最強、危害最大、流行最為廣泛的血清型。1998年江蘇和2005年四川人感染豬鏈球菌病疫情大暴發(fā)的病原也是血清2型菌株[35-37]。

研究將本實驗室自2005-2020年收集的，來自浙江省10個地市散發(fā)病人的分離株進行了復蘇。鑒于傳統(tǒng)的微生物檢測鑒定手段一般都難以用一種手段獲得準確可靠的鑒定信息，本次在傳統(tǒng)細菌學方法鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合近年來發(fā)展的蛋白質(zhì)譜技術(shù)以及核酸檢測技術(shù)對收藏復活菌株全部進行了綜合鑒定，共鑒定出SS2菌株28株。需要說明的是，在菌株使用VITEK 2 Compact儀器鑒定時，菌株一定要新鮮菌落，18～20 h培養(yǎng)即可，制作懸液時盡量均一分散，濃度符合，否則鑒定可信值偏低甚至于鑒定為其它鏈球菌類；MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果快速，只要靶板孔內(nèi)涂菌均勻適量，其他要求不高，不失為實驗室快檢好幫手。但上述兩種儀器檢測結(jié)果鑒定到種水平，個人認為是可信的，如確定到具體血清型別，仍需結(jié)合血清學玻片凝集試驗再次確認。有條件的實驗室，不妨再結(jié)合核酸快診技術(shù)，檢測特異性種及型別基因，相互佐證以作綜合判斷。 不同豬鏈球菌菌株之間毒力存在差異，如何確定豬鏈球菌的毒力水平一直以來都是一個難題。比較一致的一個觀點是細菌的致病力來自于不同毒力因子在致病過程中的協(xié)同作用。因此，相比其它分型方法,基于毒力基因譜的分型方法能夠更好的將其與細菌的毒力相關(guān)聯(lián)[38-39]。早期，大多數(shù)豬鏈球菌的毒力因子研究僅集中于mrp、epf和sly，并根據(jù)毒力因子的差異，將菌株分為強毒力株(mrp+epf+)、弱毒力株(mrp+epf-)、無毒力株(mrp-epf-)[40]。后來學者們又增進Cps2J、orf2、fbps、gdh、gapdh毒力因子的檢測研究。2015年董文陽等[41]報道通過PCR檢測101株SS2中的22個毒力相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)所有菌株被分成兩個毒力基因群，其中B群epf、sly、SpyM3_0908、endoD、SMU_61-like和rgg檢出率很高，但在A群中檢出率低，鑒于單個毒力因子的存在與否很少決定毒力[39]，因此該研究推測毒力因子的特定組合可能至關(guān)重要，據(jù)此結(jié)合毒力實驗測試，研究認為B群應為強毒力基因群，揭示了來自中國的強毒和低毒SS2分離株之間的遺傳差異。本研究參考上述報道，對28株SS2進行了24種毒力基因的檢測，除salKR毒力基因檢出率僅為46.43%外，1株ZJ-31菌株(經(jīng)查為2018年分離)其毒力群基因檢測結(jié)果與另外27株SS2菌株有明顯不同，未檢測出epf、sly、endoB、Permease、rgg及sum_61這6種毒力基因，而其它27株則均有檢測出23種毒力基因，這可能與該菌株的遺傳進化背景不同相關(guān)。鑒于此，本次對28株SS2菌株16SrRNA基因進行了測序，Mga 7.0軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹，分析顯示，28株菌株被分成2個進化分枝，其中27株菌株同源性極高歸屬為同一進化分枝，僅1株ZJ-31菌株另分為一枝進化群，此與上述毒力群基因檢測結(jié)果似乎相符。結(jié)果提示，2005-2018年浙江省豬鏈球菌病散發(fā)流行株攜帶多個相同毒力群基因，各菌株間雖沒有相關(guān)的流行病學資料佐證，但通過對16SrRNA基因進化分析，各菌株長期處在一個相對穩(wěn)定的進化狀態(tài)，可能各菌株來源背景相同。直至2018年，出現(xiàn)個別分離株其攜帶毒力群基因有明顯不同，遺傳進化顯示其來源或背景也有明顯不同，該變化是否有引起豬鏈球菌病致病性變化的發(fā)生以及流行病學改變，值得我們今后予以持續(xù)性關(guān)注。