液體活檢在肺癌伴惡性胸腔積液診療中的研究進(jìn)展

曾灝 田攀文 李為民

2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌作為第二常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，仍是死亡率最高的惡性腫瘤。在中國，肺癌發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首。2020年，中國新增肺癌患者達(dá)82萬，死亡人數(shù)占全球肺癌死亡人數(shù)的40%[1,2]。晚期肺癌患者的5年生存率不到15%，而Ia期肺癌患者的5年生存率可達(dá)80%‐90%[3,4]?？梢?，肺癌的早期篩查和早期診斷對提高患者生存率至關(guān)重要。

臨床上常用于篩查和診斷肺癌的工具包括胸部X線、計算機(jī)斷層掃描（computed tomography,CT）、低劑量CT以及正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography,PET）等[5,6]。胸部X線檢查敏感性差，胸部CT能發(fā)現(xiàn)肺部微小結(jié)節(jié)，但是難以區(qū)分炎性結(jié)節(jié)和早期肺癌，而動態(tài)持續(xù)影像學(xué)監(jiān)測可能會導(dǎo)致暴露于輻射下的患者引起輻射誘發(fā)的癌癥[7‐9]。確診肺癌需要組織活檢，但其為有創(chuàng)操作，存在一定風(fēng)險，難以反復(fù)多次取樣，無法實時監(jiān)測腫瘤基因突變及耐藥。此外，由于腫瘤具有異質(zhì)性，局部組織的取樣可能無法反映腫瘤基因全貌?；蚪M學(xué)技術(shù)的進(jìn)展使液體活檢應(yīng)用于腫瘤的診斷、個體化治療和預(yù)后評估成為可能[10]。

液體活檢是伴隨精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)運而生的一種新型診斷技術(shù)。顧名思義，液體活檢是利用患者血液、胸腔/腹腔/心包腔積液、腦脊液、尿液、唾液等樣本進(jìn)行檢測。與組織活檢相比，液體活檢標(biāo)本易于獲取且可反復(fù)多次取樣?；诩?xì)胞游離DNA（cell‐free DNA,cfDNA）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells,CTCs）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）、信使RNA（messenger RNA,mRNA）、外泌體等樣本的液體活檢不僅能揭示肺癌基因全貌，而且可以監(jiān)測肺癌基因的動態(tài)變化[11‐18]。利用外周血提取ctDNA是目前相對成熟的液體活檢技術(shù)，由于血液樣本易于采集，已成為檢測基因突變的常規(guī)標(biāo)本，尤其是用于監(jiān)測治療反應(yīng)和評估耐藥機(jī)制。但是血漿中ctDNA的含量極為有限，ctDNA的提取和檢測仍具挑戰(zhàn)[18‐20]。有研究探索其他含有ctDNA的體液，以作為液體活檢樣本的潛在替代品[21]。惡性胸腔積液（malignant pleural effusion,MPE）中富含腫瘤細(xì)胞，且胸腔積液樣本易于采集。2005年有學(xué)者報道了利用MPE作為1例肺癌患者液體活檢樣本檢測到表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變的病例報告[22]，開辟了研究以MPE作為液體活檢樣本的新道路。本文對液體活檢在肺癌伴MPE診斷與治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 惡性胸腔積液

MPE是指經(jīng)病理學(xué)證實存在脫落的腫瘤細(xì)胞或胸膜活檢組織發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的胸水樣本。MPE積聚在臟層胸膜和壁層胸膜之間，由腫瘤細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移至胸膜，影響胸水的濾出或吸收所致[23,24]。MPE是晚期惡性腫瘤的常見并發(fā)癥，肺癌是其最常見的病因，約占30%[25,26]。約15%的肺癌患者在初診時就已出現(xiàn)MPE，而在疾病發(fā)展過程中，近40%的患者將發(fā)生MPE[27]。

伴隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的到來，肺癌的治療由傳統(tǒng)的化療逐漸向分子靶向和免疫治療發(fā)展。酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）小分子靶向治療是驅(qū)動基因陽性晚期非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer,NSCLC）的一線標(biāo)準(zhǔn)治療，而檢測腫瘤驅(qū)動基因是制定治療決策的前提[28]。與組織活檢相比，MPE易于收集且富含大量腫瘤細(xì)胞。

有研究[26]證實肺腺癌伴MPE患者的胸水樣本所檢測到的EGFR突變率高于手術(shù)切除的肺腺癌組織樣本（68.4%vs50.5%）。Wang等[29]檢測了295例肺腺癌患者M(jìn)PE樣本，其中92例具有匹配的組織樣本，研究發(fā)現(xiàn)，MPE上清液樣本中EGFR突變率為39.3%，與組織樣本的一致性達(dá)87.1%；以組織為金標(biāo)準(zhǔn)，MPE上清液樣本檢測EGFR突變的敏感性和特異性分別為71.4%和96.5%。同樣，胸水樣本能準(zhǔn)確檢測EGFR突變亞型，有研究利用二代測序（next generation sequencing,NGS）技術(shù)，證明了在胸水中所檢測到的EGFR敏感突變的豐度（突變豐度是指在該基因位點所有的等位基因中，突變等位基因所占的比例）均要高于血液樣本中的突變豐度[30]。此外，在靶向治療過程中尚未出現(xiàn)影像學(xué)進(jìn)展時，可以利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）或NGS等技術(shù)在ctDNA中檢測到EGFRT790M突變，有助于進(jìn)行早期臨床干預(yù)[31‐33]。MPE是提供EGFR突變信息的可靠的液體活檢樣本，對指導(dǎo)晚期NSCLC靶向治療的藥物選擇具有重要的臨床價值。

2 MPE中cfDNA的應(yīng)用價值

cfDNA是正常細(xì)胞和癌細(xì)胞在發(fā)生壞死和凋亡過程中釋放到血液循環(huán)中小片段的DNA，而由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放的這部分則稱為ctDNA，ctDNA能夠反映腫瘤的遺傳特征[12,18,34]。ctDNA不僅可用于NSCLC的早期篩查和診斷，也能用于指導(dǎo)治療及評估預(yù)后和復(fù)發(fā)[35,36]。與從腫瘤組織中分離出的DNA相比，血漿ctDNA具有較高的敏感性和特異性（分別為88%和100%），是檢測EGFR突變的可靠方法[37]。除了能在血漿中得以分離，ctDNA也存在于胸水、腹水及其他體液中[38]。Kimura等[39]研究表明，胸腔積液中的cfDNA可檢測出EGFR突變，且與EGFR‐TKI治療的療效相關(guān)。Wang等[29]將從MPE上清液中提取DNA檢測出的EGFR突變的晚期NSCLC患者進(jìn)行EGFR‐TKI治療，發(fā)現(xiàn)其客觀緩解率（objective response rate,ORR）為57.6%，無進(jìn)展生存期（progression free survival,PFS）為8.9個月，總生存期（overall survival,OS）為29.8個月，而組織和血漿中檢測出EGFR突變的患者，其ORR分別為56.0%和47.4%，PFS分別為9.0個月和7.7個月，OS分別為25.9個月和25.3個月。MPE上清液還可檢測間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）和肉瘤致癌因子‐受體酪氨酸激酶（C‐ros oncogene 1,ROS1）融合基因。Yao等[40]研究了16例MPE中檢測出ALK或ROS1融合基因并接受靶向治療的晚期NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)8例患者獲得部分緩解（partial response,PR），4例疾病穩(wěn)定（stable disease,SD），4例疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）。此外，與配對的細(xì)胞塊及血漿樣本檢測相比，胸水上清液中能檢測出更高的基因突變豐度，能提供更為全面的基因信息[20]。Yu等[41]發(fā)現(xiàn)MPE上清液中的長片段cfDNA會引入低豐度的與癌癥不相關(guān)的變體，推薦在臨床實踐中，直接檢測總cfDNA，而不是片段化處理后再檢測?？傊瑥腗PE中提取cfDNA用于檢測NSCLC的基因突變是可行的，MPE是在腫瘤組織不可獲取時檢測基因突變的有效替代物，MPE的檢測結(jié)果可用于指導(dǎo)臨床治療決策[40,42‐46]（表1）。

表1 液體活檢在惡性胸腔積液中的研究匯總Tab 1 Clinical studies of liquid biopsy in malignant pleural effusion

3 MPE中EVs的應(yīng)用價值

EVs是活細(xì)胞以旁分泌的形式釋放到微環(huán)境中的膜性小囊泡，包含各類蛋白質(zhì)、核酸（如DNA、miRNA、mRNA等）以及脂類和細(xì)胞代謝物等，大小在50 nm‐150 nm的EVs則稱為外泌體，直徑在50 nm‐1,000 nm的則稱為微囊泡[47,48]。不同來源的EVs具有不同的功能，腫瘤細(xì)胞來源的EVs具有改變腫瘤微環(huán)境的能力，能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[49‐51]。EVs能從包括胸腔積液在內(nèi)的大多數(shù)體液中提取分離，來源于EVs的DNA非常適合于EGFR基因分型以及T790M耐藥突變的檢測。Lee等[52]比較了MPE中cfDNA與MPE中EVs來源的DNA對EGFR基因的檢出率，發(fā)現(xiàn)EVs來源的DNA對EGFR的檢出率較cfDNA更高，其檢出率分別為100%（19/19）和89%（17/19）；EVs來源的DNA對EGFR‐TKI治療耐藥后繼發(fā)性T790M突變的檢出率較cfDNA同樣更高，分別為72.2%（13/18）和61.1%（11/18）。此外，來自于胸腔積液的EVs與來自于原發(fā)肺癌細(xì)胞的EVs具有相似的生化特性，其中的蛋白同樣高度富集，與肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Park等從NSCLC患者的MPE中提取的EVs發(fā)現(xiàn)，EVs包含了912種不同的蛋白，其中EGFR蛋白、ras家族蛋白、Src酪氨酸激酶、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6（carcinoembryonic antigen‐related cell adhesion molecule 6,CEACAM6）和胞質(zhì)無機(jī)焦磷酸酶等可作為診斷肺癌的新型生物標(biāo)志物[38,52‐54]。

4 MPE中miRNA的應(yīng)用價值

如前所述，EVs不僅包含了多種肺癌診斷的蛋白標(biāo)志物，也包含了miRNA在內(nèi)的多種核酸。miRNA是一種穩(wěn)定性好的非編碼單鏈小RNA，介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)控腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，同樣在MPE的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[55,56]。miRNA難以被RNA酶降解，且在各類RNA中含量最高，能在包括肺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中表達(dá)，是診斷肺癌的新型生物標(biāo)志物[57‐59]。Khandelwal等[60]報道，在NSCLC中，microRNA‐590‐5p通過調(diào)節(jié)STAT3通路發(fā)揮腫瘤抑制作用，可以作為診斷NSCLC和評估預(yù)后的生物標(biāo)志物，并可能成為治療NSCLC的潛在靶點。miRNA除了在外周血中循環(huán)，在NSCLC患者的胸水中也能檢出[57]，用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷。相較于良性胸腔積液，miRNA‐134、miRNA‐22、miRNA‐198和miRNA‐185在肺腺癌的MPE中顯著低表達(dá)，而miRNA‐195‐5p、miRNA‐182‐5p、miRNA‐34a‐5p和miRNA‐210則顯著高表達(dá)[55,61‐63]。除了鑒別良惡性胸腔積液外，miRNA也能用于協(xié)助診斷NSCLC。miRNA‐200 家族（miRNA‐200b、miRNA‐200c、miRNA‐141）、miRNA‐375、miRNA‐429、miRNA‐483‐5p、miRNA‐200a‐3p、miRNA‐203a‐3p、miRNA‐205‐5p等在肺腺癌患者的胸水中顯著增高，對肺腺癌具有較好的診斷效能[56,64]。此外，來源于MPE的miRNA可用于指導(dǎo)NSCLC患者的治療，也可用于其預(yù)后的評估。其中，miRNA‐93通過血管生成素2（angiopoietin 2,Ang2）可抑制血管和淋巴管的生成，miRNA‐93/Ang2可能是腫瘤治療的潛在靶點。接受EGFR‐TKI治療的NSCLC患者中，miRNA‐200c‐3p高表達(dá)患者的PFS顯著長于低表達(dá)患者，缺乏miRNA‐200c‐3p表達(dá)的患者則耐藥增加；Wang等[65‐69]分析了184例NSCLC患者的MPE樣本，發(fā)現(xiàn)胸水中miRNA‐141、miRNA‐93、miRNA‐134、miRNA‐151和miRNA‐345的低表達(dá)與患者較短的總生存期顯著相關(guān)。

5 血液樣本與MPE樣本的比較

盡管目前臨床上用于液體活檢的樣本仍主要是血液樣本，但血液樣本中ctDNA的含量極為有限，越來越多的研究轉(zhuǎn)向?qū)π厮畼颖镜奶剿?。研究發(fā)現(xiàn)，MPE上清液中的總cfDNA濃度顯著高于血漿，其中位值分別為278.1 ng/mL和20.4 ng/mL。此外，MPE上清液中的ctDNA檢測到體細(xì)胞突變的頻率比MPE沉淀物和血漿樣本更高，分別為98.4%（62/63）、90.5%（57/63）和87%（55/63），EGFR突變檢出率也更高[70]。Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，MPE上清液中EGFR的突變檢出率為39.3%（116/295），而血漿中突變檢出率僅為27.4%（68/248）。Guo等[20]研究發(fā)現(xiàn)，對于肺癌相關(guān)的168個基因的檢出率，MPE上清液的檢出率高于血漿樣本，分別為87%（134/154）、83.1%（128/154），盡管無統(tǒng)計學(xué)差異，但MPE上清液的中位最高突變豐度（maximum allelic fraction,maxAF）卻顯著高于血漿樣本，分別為20.3%和1.13%。Tong等[70]發(fā)現(xiàn)，以組織樣本所檢出的驅(qū)動基因突變?yōu)榻饦?biāo)準(zhǔn)，胸水來源的cfDNA中驅(qū)動基因突變的檢出率為93%（27/29），而血漿cfDNA中的檢出率僅為62%。胸水樣本中ctDNA檢測EGFR基因突變的敏感性和準(zhǔn)確性分別為75.76%（25/33）和80.0%（32/40），均顯著高于血液樣本，血液樣本分別為48.48%（16/33）和57.50%（23/40）[71]。Son等[46]研究發(fā)現(xiàn)，MPE上清液檢測EGFR的敏感性為84.4%，特異性為97.1%，而血漿樣本檢測EGFR的敏感性和特異性分別為70.6%和100%；MPE上清液對EGFR外顯子19缺失突變檢測的敏感性和特異性分別為93.8%和100%，而血漿檢測分別為75.0%和100%；對EGFR‐L858R突變，MPE上清液檢測的敏感性和特異性分別為73.3%和98.1%，而血漿檢測分別為60.0%和100%。此外，Hummelink等[45]報道胸水上清液cfDNA可用于檢測EGFR耐藥突變，用于指導(dǎo)EGFR‐TKI耐藥后的治療策略。綜上，胸水在檢測腫瘤驅(qū)動基因突變方面優(yōu)于血液，可以提供有價值的臨床信息，是基因檢測更可靠的樣本來源[72]。

6 總結(jié)

相比于血液樣本，MPE中富含腫瘤細(xì)胞和腫瘤DNA，是檢測肺癌基因信息極佳的樣本來源，尤其是胸水上清液。MPE中所含的cfDNA、外泌體和miRNA等循環(huán)標(biāo)志物的檢測，能協(xié)助鑒別良惡性胸腔積液，實現(xiàn)腫瘤的分子分型，發(fā)現(xiàn)腫瘤的耐藥突變，指導(dǎo)NSCLC精準(zhǔn)靶向治療，探索潛在的新型治療靶點，并評估患者的預(yù)后。在EGFR‐TKI治療過程中，對MPE樣本進(jìn)行檢測，能早期發(fā)現(xiàn)疾病的進(jìn)展，從而實現(xiàn)早期干預(yù)，改善患者預(yù)后，降低患者的死亡率。