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    口腔鱗狀細(xì)胞癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及其臨床意義

    2021-10-21 05:20:48張帥源秦碩李光輝易雅群付昊杰高雅靖孫明磊
    華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:外周血特異性程度

    張帥源 秦碩 李光輝 易雅群 付昊杰 高雅靖 孫明磊

    鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科,鄭州450052

    口腔頜面部惡性腫瘤是全球十大惡性腫瘤之一,其中約90%為鱗狀細(xì)胞癌,其次為腺性上皮癌,間葉組織來(lái)源腫瘤少見(jiàn)[1]。過(guò)度飲酒、吸煙、咀嚼檳榔、不良習(xí)慣及長(zhǎng)期物理化學(xué)因素的刺激是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)最主要的發(fā)病因素,近年來(lái)有文獻(xiàn)[2-4]報(bào)道人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)也與OSCC發(fā)病有關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后最主要因素,隨著手術(shù)與放、化療等醫(yī)療手段的進(jìn)步,OSCC患者的預(yù)后雖得到相當(dāng)?shù)母纳?,?年生存率仍低于50%[5],因此尋找一種更為簡(jiǎn)便且有效的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)尤為重要。

    循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)是一種有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向的,短暫的腫瘤轉(zhuǎn)移前體細(xì)胞。在1869年由Thomas Ashworth提出,他發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液里存在與自身瘤體相同的細(xì)胞組織,該發(fā)現(xiàn)后續(xù)在1954年被Watanabe等證實(shí)。CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6],由于CTCs本身來(lái)源于腫瘤組織,與腫瘤組織具有相同的遺傳物質(zhì)[7],將其用于腫瘤的識(shí)別和定性,特異性極高[8]。但是外周血中的CTCs含量極少,檢測(cè)難度較高,理想的CTCs檢測(cè)方法必須能夠分離并檢測(cè)所有異質(zhì)CTCs,同時(shí)丟棄正常血細(xì)胞的大背景[9]。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,最新的陰性富集及靶向聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)技術(shù)成功解決了上述問(wèn)題,該方法基于CTCs與正常血細(xì)胞表面抗原CD45+之間的表達(dá)差異,利用免疫磁珠將兩者分離并最大限度的將CTCs純化,大幅提高了檢測(cè)質(zhì)量[10],這使CTCs在惡性腫瘤的輔助診斷、判斷療效和預(yù)后等方面受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。但目前CTCs與OSCC相關(guān)性的研究報(bào)道較少見(jiàn)。葉酸受體(folate receptor,F(xiàn)R)是一組跨膜蛋白,分為α、β和γ三種亞型,由于FR在人體大部分的腫瘤細(xì)胞中都有特異性高表達(dá),如卵巢癌、肺癌,而在正常組織中少有表達(dá),是一種理想的CTCs檢測(cè)靶點(diǎn)[11]。據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道,OSCC組織中亦可見(jiàn)FR高表達(dá),本研究應(yīng)用的陰性富集及靶向PCR(FR+CTC)檢測(cè)技術(shù)即利用該點(diǎn),以腫瘤表面FR為靶點(diǎn),檢測(cè)OSCC患者外周血的CTCs,分析其與腫瘤患者病理分期、病理亞型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床分期等臨床病理特征間的關(guān)系,探討CTCs檢測(cè)的價(jià)值和應(yīng)用前景。

    1 材料和方法

    1.1 一般資料

    選擇2019年5月—2020年5月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的93例OSCC患者為試驗(yàn)組,同期選取20例健康志愿者為對(duì)照組。試驗(yàn)組中,男64例(68.8%),女29例(31.2%),年齡25~78歲,平均年齡(51.50±12.53)歲;對(duì)照組中,男9例(45%),女11例(55%),年齡22~69歲,平均年齡(44.60±12.66)歲。

    本研究納入標(biāo)準(zhǔn):1)病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌;2)除OSCC外無(wú)其他部位原發(fā)惡性腫瘤以及嚴(yán)重全身性疾??;3)入院前未接受放化療及手術(shù)等其他相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):1)入院前曾接受放化療及手術(shù)等其他相關(guān)治療;2)嚴(yán)重感染或肝腎功能?chē)?yán)重異常;3)生活不能自理或不能配合治療者。

    1.2 CTCs的富集與檢測(cè)

    CTCs的檢測(cè)采用負(fù)向富集及靶向PCR檢測(cè)技術(shù)。嚴(yán)格遵循采血標(biāo)準(zhǔn),取患者3 mL靜脈血,血樣中加入紅細(xì)胞裂解液孵育,紅細(xì)胞裂解后離心,加入CD45+磁珠結(jié)合白細(xì)胞,用磁場(chǎng)捕獲并去除白細(xì)胞,剩余富含CTCs的細(xì)胞群,加入特異性探針(針對(duì)表達(dá)FRα的細(xì)胞設(shè)計(jì),由靶向FR的葉酸單元與共價(jià)偶聯(lián)的寡核苷酸單元組成)標(biāo)記CTCs,離心,去除上清液游離探針,加入洗脫劑,洗脫與CTCs特異性結(jié)合的探針,制備待測(cè)樣品,加入PCR擴(kuò)增試劑后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增模板的寡核苷酸單元序列為:5’-CTCAACTG‐GTGTCGTTGGGCAATTCAGTTGATTCTAA-3’),經(jīng)數(shù)據(jù)分析,計(jì)算出3 mL血樣中CTCs的含量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用R4.0.0(R Foundation for Statistical Com‐puting,澳大利亞)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,單組間比較使用了Kruskal-Wallis檢驗(yàn),多組間使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用受試者工作曲線(re‐ceiver operating characteristic curve,ROC)分析外周血CTCs對(duì)OSCC相關(guān)的診斷價(jià)值,并通過(guò)其敏感度和特異性來(lái)計(jì)算約登指數(shù)。多因素分析采用線性回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 2組外周血CTCs值的比較

    OSCC患者的術(shù)前CTCs值中位數(shù)=10.8,四分位范圍=[9.7,13.6],對(duì)照組的CTCs值中位數(shù)=8.00,四分位范圍=[7.67,8.10],試驗(yàn)組顯著大于對(duì)照組(P<0.000 1)(圖1)。

    圖1 OSCC組與對(duì)照組CTCs的比較Fig 1 Comparison of CTCs values between OSCC group and the control group

    2.2 外周血CTCs與OSCC臨床病理特征的關(guān)系

    外周血CTCs與患者的性別、周?chē)M織浸潤(rùn)、發(fā)病部位等無(wú)關(guān)(P>0.05)。與患者的年齡(P=0.022)、OSCC的分化程度(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.006 4)、腫瘤T分期(P=0.02)、N分期(P=0.007 5)及臨床分期(P=0.029)、早晚期相關(guān)(P=0.022)等相關(guān),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。M1期患者CTCs值較M0期顯著增高,Ⅲ+Ⅳ期患者CTCs值高于Ⅰ+Ⅱ期者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖2)。

    圖2 CTCs與OSCC臨床病理特征的關(guān)系圖Fig 2 The relationship between CTCs and clinicopathological features of OSCC patients

    表1 OSCC患者外周血CTCs與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 The relationship between CTCs and clinico‐pathological features of OSCC patients

    2.3 CTCs診斷價(jià)值分析

    2.3.1 外周血CTCs檢測(cè)對(duì)OSCC的診斷價(jià)值 應(yīng)用CTCs診斷OSCC的AUC值為0.925,檢驗(yàn)?zāi)苄杂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.000,95%CI(0.876,0.974)],當(dāng)CTCs值為8.450 FU/3 mL時(shí),約登指數(shù)最大為0.853,敏感度90.3%,特異性95.0%(圖3)。

    圖3 CTCs用于診斷OSCC的ROC曲線Fig 3 The ROC curve of CTCs in diagnosis of OSCC

    2.3.2 外周血CTCs檢測(cè)對(duì)OSCC轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值應(yīng)用CTCs診斷OSCC轉(zhuǎn)移的AUC值為0.691,檢驗(yàn)?zāi)苄杂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.000,95%CI(0.580,0.803)],當(dāng)CTCs值為12.250 FU/3 mL時(shí),約登指數(shù)最大為0.367,敏感度63.6%,特異性73.3%(圖4)。

    圖4 CTCs用于診斷OSCC轉(zhuǎn)移的ROC曲線Fig 4 The ROC curve of CTCs in diagnosis of OSCC metastasis

    2.4 CTCs與OSCC患者臨床病理特征之間的多因素回歸分析

    將單因素分析中P<0.2的變量全都納入到了多因素線性回歸模型中。納入的變量包括性別、年齡、發(fā)病部位、分化程度、周?chē)M織浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、M分期以及臨床分期等。使用逐步回歸法篩選變量,得到以下模型。腫瘤原發(fā)于頰部與OSCC患者CTCs值呈負(fù)相關(guān)(P=0.001 08);N2分期(P=0.000 74)及M分期(P=0.026 38)與OSCC患者CTCs值呈正相關(guān);腫瘤分化程度中高分化(P<0.000 1)和中分化(P=0.001 5)與OSCC患者CTCs值呈負(fù)相關(guān),分化越高,CTCs值越低。

    表2 CTCs與OSCC患者臨床病理特征之間的多元素回歸分析Tab 2 Multielement regression analysis of clinicopathological features between CTCs and OSCC patients

    3 討論

    在OSCC臨床診治中發(fā)現(xiàn)有部分TNM分期較早的患者,雖無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù),并接受了根治性手術(shù),但仍在一段時(shí)間后發(fā)生了腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,考慮這部分早期OSCC患者術(shù)前已發(fā)生了微轉(zhuǎn)移,此前常規(guī)的術(shù)前臨床檢查手段并不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的亞臨床病灶[13],隨著醫(yī)療水平的提高,近年來(lái)應(yīng)用CTCs等“液體活檢”技術(shù)為篩查OS‐CC提供了新的思路[14-16]。

    CTCs是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱,因自發(fā)或診療操作從實(shí)體瘤病灶脫落,進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,并可以在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[17]。腫瘤釋放至外周血中CTCs的多少,可直接的反映出腫瘤發(fā)生、發(fā)展的功能狀態(tài)。在乳腺癌[18]、肺癌[19]等腫瘤中,CTCs已成為了較可靠的腫瘤標(biāo)記物,用于評(píng)估患者的治療效果、無(wú)進(jìn)展生存期和預(yù)后[20]。CTCs在口腔頜面部腫瘤中的研究起步稍晚,Buglione等[21]研究表明CTCs在頭頸部腫瘤患者中表達(dá)水平與腫瘤分期、腫瘤負(fù)荷、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這些高危參數(shù)顯著相關(guān)。

    目前CTCs檢測(cè)方法較多,各類方法靈敏度及特異性參差不齊。本研究采用的陰性富集及靶向PCR檢測(cè)技術(shù)較為先進(jìn),有較高的臨床參考價(jià)值。通過(guò)檢測(cè),單因素分析中OSCC患者外周血CTCs與健康人群相比明顯升高,表明CTCs值的升高與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),有助于腫瘤的早期診斷,這與其他學(xué)者[22]的研究一致。在CTCs與OSCC臨床特征關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),≥60歲組患者的CTCs值明顯較高,考慮可能與該組患者中Ⅳ期占比較高(48%)有關(guān),說(shuō)明年齡為OSCC危險(xiǎn)因素之一,老年患者更應(yīng)密切隨訪,這是腫瘤治療過(guò)程中關(guān)鍵步驟。在外周血CTCs與OSCC臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn),CTCs與OSCC的分化程度相關(guān),腫瘤分化程度越低,惡性程度越高,外周血CTCs值越高,反之亦然,筆者認(rèn)為可能是因?yàn)閻盒猿潭雀叩哪[瘤更易侵入小血管壁,從而更易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。OSCC組患者中,外周血CTCs值隨T分期、N分期增高而呈總體上升趨勢(shì),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,M1期組高于M0期組,表明外周血CTCs水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)密切相關(guān),臨床上遇到CTCs檢測(cè)值較大的患者,醫(yī)生應(yīng)盡可能完善相關(guān)檢查,確定腫瘤負(fù)荷大小,有無(wú)臨床轉(zhuǎn)移跡象,明確手術(shù)適應(yīng)證。另外CTCs與有無(wú)腫瘤周?chē)M織浸潤(rùn)之間雖差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但有腫瘤周?chē)M織浸潤(rùn)組CTCs值較無(wú)浸潤(rùn)組增高,考慮可能由于樣本量不足導(dǎo)致偏倚,后續(xù)筆者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步比較。在CTCs與臨床分期的關(guān)系研究中也發(fā)現(xiàn),CTCs與患者臨床分期相關(guān),發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期患者的CTCs值較Ⅰ+Ⅱ期者明顯升高,這與周士超等[23]的研究結(jié)果相一致,表明通過(guò)檢測(cè)CTCs值有助于輔助判斷患者臨床分期,對(duì)OSCC臨床診療有一定的指導(dǎo)意義。由于僅依靠單因素分析,各變量的真實(shí)效應(yīng)有可能被其他混雜變量所掩蓋,因此增加了多因素分析控制偏倚,通過(guò)推導(dǎo)CTCs與OSCC之間的線性回歸方程得出頰部,N2分期,M分期,中、高分化程度等因素均為OSCC患者術(shù)前CTCs的獨(dú)立影響因素。以上結(jié)果表明檢測(cè)CTCs有助于判斷腫瘤的惡性程度、進(jìn)展情況、病理分級(jí),CTCs值可一定程度反映出腫瘤的活躍程度和疾病的進(jìn)展程度,可成為較為可靠的腫瘤監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。本研究通過(guò)對(duì)照組和OSCC組CTCs值繪制ROC曲線,計(jì)算出應(yīng)用CTCs值診斷OSCC的AUC值為0.925,通過(guò)其敏感度及特異性計(jì)算出其約登指數(shù)為0.853,所對(duì)應(yīng)的外周血CTCs值為8.450 FU/3 mL,敏感度與特異性均>90%,有較高的檢驗(yàn)效能和臨床診斷價(jià)值。將其應(yīng)用于OSCC的篩查和輔助診斷,當(dāng)CTCs檢測(cè)值<8.450 FU/3 mL時(shí),有較小患癌可能,若高于此值,則需密切隨訪或行必要的檢查來(lái)排查患癌可能。同樣通過(guò)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組之間CTCs值繪制ROC曲線,評(píng)估CTCs對(duì)OSCC轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值,計(jì)算出AUC值為0.367(P=0.000),約登指數(shù)為0.44,相對(duì)應(yīng)的CTCs值為12.250 FU/3 mL,敏感度為63.6%,特異性為73.3%,當(dāng)OSCC患者CTCs值>12.250 FU/3 mL時(shí)有較大轉(zhuǎn)移可能,具有一定的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)價(jià)值。

    本研究結(jié)果表明,CTCs的檢測(cè)對(duì)于OSCC的早期篩查、輔助診斷及轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)等均具有重要的臨床意義。本研究也存在一定不足,由于隨訪時(shí)間較短,未能進(jìn)行完整的預(yù)后分析,后續(xù)將加強(qiáng)隨訪,進(jìn)一步探討CTCs對(duì)OSCC預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

    綜上所述,外周血CTCs的檢測(cè),對(duì)OSCC的早期篩查、輔助診斷、評(píng)估轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤的惡性程度,進(jìn)展情況、病理分級(jí)等均有較為重要的臨床價(jià)值,是一個(gè)較為可靠的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)。

    利益沖突聲明:作者聲明本文無(wú)利益沖突。

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