2015—2019 年遼寧省麻疹病毒基因型及流行株血凝素基因特征分析

郝爽，王文思，方興，王艷

遼寧省疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃所，遼寧沈陽(yáng)110005

麻疹病毒（measles virus，MEV）是副黏病毒科，麻疹病毒屬成員，為單股負(fù)鏈RNA 病毒。病毒基因組有6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因，編碼6 個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白（nucleoprotein，N）、磷酸化蛋白（phosphoprotein，P）、膜蛋白（matrix ，M）、血溶素蛋白（fusion，F(xiàn)）、血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）蛋白和依賴于RNA的 RNA 聚合酶（large protein，L）。其中 H 蛋白能參與病毒感染，與宿主細(xì)胞受體吸附［1-2］。病毒感染后產(chǎn)生抗H 抗體，具有中和病毒的作用，因此，H 蛋白是研究麻疹病毒特征的重要蛋白。

麻疹病毒有24 個(gè)基因型，但僅有1 個(gè)血清型，因此，有效的疫苗接種有望實(shí)現(xiàn)消除計(jì)劃［3-4］，2014年之前，遼寧省監(jiān)測(cè)到的麻疹病毒均為H1a 基因型，本文對(duì)2014 年經(jīng)歷麻疹大流行后，2015 — 2019 年遼寧省流行的麻疹病毒基因型及流行株H 基因特征進(jìn)行分析，探討其是否發(fā)生變化，以期為實(shí)現(xiàn)消除麻疹目標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 麻疹病毒序列來(lái)源 本研究中共獲取53 條麻疹病毒序列，其中30 條來(lái)自2015 — 2019 年分離的麻疹病毒，23 條來(lái)自麻疹疑似病例的原始咽拭子或尿液標(biāo)本。標(biāo)本的采集處理和病毒分離方法按照《麻疹診斷標(biāo)準(zhǔn)》WS 296-2008、《麻疹診斷》WS 296-2017 的要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器 Rneasy mini kit 和One-step RTPCR ki（t100，貨號(hào)：210212）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司。

1.3 麻疹病毒RNA 提取及RT-PCR 采用Rneasy mini kit 提取麻疹病毒RNA，用One-step RT-PCR kit 擴(kuò)增病毒N 基因羧基末端450 bp 核苷酸和H 基因全長(zhǎng)1854bp 核苷酸，RT-PCR 引物及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［5］。

1.4 序列測(cè)定及結(jié)果分析 擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物送至北京賽默飛測(cè)序有限公司進(jìn)行純化及序列測(cè)定。利用MEGA 5.0 和Sequencher-4.0.5 軟件對(duì)N 基因（450 bp）和 H 基因（1 854 bp）測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和處理分析，調(diào)出GenBank 中WHO 推薦的麻疹病毒N 和H 參考株進(jìn)行核苷酸和氨基酸比對(duì)分析（pdistance 模型），并構(gòu)建進(jìn)化樹（鄰位-連接法，bootstrap檢驗(yàn)，抽樣次數(shù) 500，Kimura-2 Parameter 模型）。

2 結(jié) 果

2.1 2015—2019 年遼寧省流行的麻疹病毒基因型別 將2015 — 2019 年獲得的53 個(gè)麻疹病毒序列N 基因末端450 bp 核苷酸與WHO 參考株進(jìn)行基因序列比對(duì)，構(gòu)建的基因親緣性關(guān)系樹見(jiàn)圖1，47 株病毒為 H1a 基因型，1 株為 D8 基因型（2018 年），該株D8基因型為我省首次檢測(cè)到，5 株為A 基因型（全部為臨床標(biāo)本）。

圖1 2015 — 2019 年遼寧省麻疹病毒與WHO 參考株基于N 基因（450 bp）構(gòu)建的基因親緣性關(guān)系樹Fig.1 Phylogenetic tree of measles virus and WHO refe-rence strain based on N gene（450 bp）in Liaoning Province from 2015 to 2019

2.2 2015—2019 年遼寧省麻疹病毒H1a 基因型流行株H 基因特征分析 2015 — 2019 年共分離出毒株30 株，應(yīng)用RT-PCR 對(duì)30 株毒株的H 基因全長(zhǎng)1 854 個(gè)核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，并與WHO 參考株進(jìn)行比對(duì)分析，29 株為 H1a 基因型，1 株（Liaoning2018-03）為D8 基因型（2019 年未分離到麻疹毒株），見(jiàn)圖2。

2.3 核苷酸與氨基酸變異分析 29 株H1a 基因型麻疹病毒H 基因核苷酸序列同源性為98.0% ～100%，氨基酸序列同源性為97.5% ～100%，與我國(guó)H1a 參考株China93-4 核苷酸序列同源性為98.6%～99%，氨基酸序列同源性為98.3% ～99%；與我國(guó)目前使用的疫苗株Shanghai-191 核苷酸序列同源性為94.4%～95.3%，氨基酸序列同源性為90.3%～90.8%。我省首次分離到的D8 基因型麻疹病毒與我國(guó)疫苗株Shanghai-191 核苷酸序列同源性為96.4%，氨基酸序列同源性為97.1%。

2.4 遺傳距離 2015—2019 年分離到的29 株H1a基因型麻疹病毒分為兩個(gè)簇：Cluster1 和Cluster2，Cluster1 和Cluster2 之間核苷酸和氨基酸平均遺傳距離分別為0.018 和0.021。Cluster1 和Cluster2與疫苗株Shanghai-191 核苷酸和氨基酸平均遺傳距離分別為 0.054 和 0.093，0.056 和 0.093。見(jiàn)圖2。

圖2 2015 — 2019 年遼寧省麻疹病毒與WHO 參考株基于H 基因（1 854 bp）構(gòu)建的基因親緣性關(guān)系樹Fig.2 Phylogenetic tree of wild strain measles and WHO reference strain based on H gene（1 854 bp）in Liaoning Province from 2015 to 2019

2015 — 2019 年分離的H1a 基因型麻疹病毒核苷酸及氨基酸變異最大的是2018 年，且隨年份增加，遺傳距離有逐漸增大趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

表1 2015 — 2019 年H1a 基因型麻疹病毒分離株與疫苗株H 基因組間平均遺傳距離比較Tab.1 Comparison of mean genetic distance of H genomes of isolates and vaccine strain of measles virus of genotype H1a from 2015 to 2019

2.5 2015—2019 年遼寧省H1a 基因型麻疹病毒流行株H 基因重要位點(diǎn)變異分析 遼寧省2015 —2019 年H1a 基因型麻疹毒株中H 蛋白保留了與疫苗株Shanghai-191 相同的4 個(gè)糖基化位點(diǎn)，這4 個(gè)位點(diǎn)分別位于 168-170（N-S-T）、187-189（N-C-S）、200-202（N-M-S）、215-217（N-V-S），但在第 5 個(gè)糖基化位點(diǎn)上238-240（N-L-S）的240 位氨基酸均由絲氨酸（SerS）突變成為天冬酰胺酸（AsnN），從而造成該糖基化位點(diǎn)的缺失。

遼寧省分離到的29 株H1a 基因型麻疹病毒分為兩個(gè)簇：Cluster1（28 株）和 Cluster2（1 株），Cluster1 所有毒株均在第397 位發(fā)生了氨基酸的替換，由脯氨酸（Pro P）突變成亮氨酸（Leu L），而 Cluster2 并未發(fā)生該改變。這29 株H1a 基因型毒株與

疫苗株Shanghai-191 相比，共同穩(wěn)定變異的有26 個(gè)氨基酸位點(diǎn)：18、133、149、211、240、243、276、280、282、303、334、359、364、397、405、420、421、423、476、481、484、562、576，603、613、614aa。

3 討 論

麻疹是一種傳染性很強(qiáng)的急性呼吸道傳染病［6-8］，本文分析了遼寧省2015 — 2019 年麻疹病毒基因型及流行株H 基因特征，結(jié)果顯示，我省48 份麻疹病毒與我國(guó)麻疹參考株China9322 ／ H1a 為同一基因型，bootstrap 值為97%，其中29 份H1a 基因型分離得到毒株，將這些野毒株與WHO 參考株基于H基因1 854 bp 進(jìn)行對(duì)比，有些毒株顯示同一年份由相同病毒傳播鏈引起，核苷酸序列同源性為100%，如Liaoning2015-07 和Liaoning2015-09。有些毒株顯示在關(guān)系樹上分布在同一個(gè)分支但不同年份，核苷酸序列同源性為100%，如LiaoningCZ-07-216-2016和LiaoningCZ-07-198-2015，表明遼寧省有相同的麻疹病毒在不同年份同時(shí)流行。

遼寧省2015 — 2019 年H1a 基因型毒株與疫苗株Shanghai-191 核苷酸及氨基酸遺傳距離分別為0.056-0.059、0.093-0.095，與遼寧省 1997 — 2014年麻疹H1a 基因型和Shanghai-191 基因型核苷酸氨基酸遺傳距離 0.049-0.055、0.042-0.051［9］有所增加，提示遼寧省H1a 基因型麻疹毒株H 基因自1997年起變異正在逐年累計(jì)，對(duì)當(dāng)前Shanghai-191 疫苗免疫效果可能會(huì)有影響。

通過(guò)分析，H1a 基因型麻疹毒株H 基因氨基末端 4 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)（168-170、187-189、200-202、215-217）均保持穩(wěn)定，第5 個(gè)糖基化位點(diǎn)238-240 上絲氨酸（SerS）突變成天冬酰胺酸（AsnN）導(dǎo)致該個(gè)糖基化位點(diǎn)消失，但該糖基化位點(diǎn)相比其他位點(diǎn)對(duì)抗原結(jié)構(gòu)及折疊的作用較小，因此，推測(cè)該糖基化位點(diǎn)的消失對(duì)蛋白的功能不會(huì)產(chǎn)生較大影響［10］。

遼寧省2015 — 2019 年以來(lái)流行的H1a 基因型麻疹毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上分成2 個(gè)獨(dú)立分支：Cluster 1 和 Cluster 2，研究發(fā)現(xiàn)，Cluster1 在 397 位點(diǎn)由脯氨酸（Pro P）突變成亮氨酸（Leu L），但 Cluster 2并未發(fā)生變化，其中Cluster 1 病毒循環(huán)數(shù)量在遼寧省更多，第379 ～410 位是麻疹病毒H 線性抗原決定簇，該氨基酸變異結(jié)果將會(huì)影響單克隆抗體與之結(jié)合，該結(jié)果與遼寧省1997 ～2014 年麻疹毒株研究一致，這也可能是Cluster1 與Shanghai-191 疫苗株相比，核苷酸遺傳距離比Cluster2 大的原因，遼寧省H1a 基因型毒株與疫苗株Shanghai-191 相比，發(fā)生穩(wěn)定變異的有26 個(gè)位點(diǎn)，303 和211 位點(diǎn)為抗原決定簇 位 點(diǎn) ，240、243、280、282、303、359、364、397、405、420、481、484、562、576 這幾個(gè)位點(diǎn)位于蛋白外模表面，它們的變異可能會(huì)導(dǎo)致抗體中和效率的下降，影響免疫效率以及持久性［11-13］。

遼寧省自1997 年開展麻疹病毒監(jiān)測(cè)以來(lái)，分離到的麻疹病毒仍以H1a 基因型為主，近年來(lái)又陸續(xù)檢測(cè)到A 基因型疫苗株病毒以及首次在2018 年分離到D8 基因型病毒［14］，我省麻疹監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)敏感性正逐漸提升。H1a 基因型病毒與疫苗株相比，在H蛋白個(gè)別氨基酸功能位點(diǎn)上發(fā)生了變異，但在進(jìn)化上并未發(fā)生重要氨基酸功能位點(diǎn)的顯著變異，遼寧省H1a 基因型麻疹病毒在絕大部分功能位點(diǎn)上保持穩(wěn)定，我國(guó)使用的麻疹疫苗對(duì)目前流行的麻疹病毒株仍具有較好的保護(hù)效果［15］。