黃芩苷通過Notch通路糾正細(xì)支氣管炎模型小鼠Th17/Treg失衡*

吳琳琳， 梁東閣， 何倩倩， 曹 歡

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院呼吸科，河南鄭州 450053）

細(xì)支氣管炎（bronchiolitis，BC）為多發(fā)于嬰幼兒的急性呼吸道感染性疾病，可能導(dǎo)致哮喘等后遺癥，威脅兒童健康。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是導(dǎo)致BC 的主要病原菌之一，具有高度傳染性和致病性，且機體無法對其產(chǎn)生充足的免疫反應(yīng)，可能重復(fù)感染，目前仍缺乏相應(yīng)的疫苗［1］。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)揮促炎作用的輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17）與抑炎作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulator T cells，Treg）的比例失衡，進一步導(dǎo)致機體Th2 免疫應(yīng)答增強，引起炎癥反應(yīng)［2］。因此，抑制Th17 細(xì)胞分化，誘導(dǎo)Treg 分化可能有效改善BC 癥狀。而Notch 通路的激活可促進Th17 分化，抑制Treg 分化，在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用［3］。另有研究證實，Notch 通路在BC 模型動物中處于激活狀態(tài)，且抑制Notch 通路可減輕BC 大鼠氣道炎癥［4］。

黃芩苷為傳統(tǒng)中藥黃芩分離的黃酮類物質(zhì)，具有消炎和抗病毒等活性［5］。多項研究表明，黃芩苷對柯薩奇B3 病毒［6］和乙肝病毒［7］等所致疾病均具有改善作用。最近研究顯示，黃芩苷在體內(nèi)和體外都可抑制RSV 病毒復(fù)制［8］，但具體作用機制并未明確。本研究采用黃芩苷治療RSV 感染的BC 模型小鼠，并通過檢測Notch 通路相關(guān)蛋白的表達、Th17 和Treg細(xì)胞比例及轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子表達水平，分析Notch 通路在黃芩苷糾正BC 模型小鼠Th17/Treg 失衡中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 40 只健康雄性BALB/c 小鼠，7 周齡，體重20～24 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。

1.2 病毒 將RSV 接種于HeLa 細(xì)胞中進行增殖培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為RPMI-1640（含10%胎牛血清），待細(xì)胞病變達80%左右時，收集病毒上清備用，另收集未接種RSV 的細(xì)胞空白培養(yǎng)基上清備用。經(jīng)空斑試驗測得本實驗中RSV滴度為1.0×1010PFU/L。

1.3 主要試劑及儀器 黃芩苷和羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）均 購 自Sigma；Notch1 激活劑重組小鼠Jagged1 蛋白、兔抗Hes1 和β-actin 單抗、兔抗Hey2 和activated Notch1 多抗及羊抗兔和大鼠IgG Ⅱ抗（Abcam）；抗CD4-APC、IL-17-PE、CD4-FITC、CD25-PE 和 叉 頭 框 蛋 白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）-APC（Invitrogen）；視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt（retinoic acid receptorrelated orphan receptor γt，RORγt）大鼠單抗（BD Biosciences）；HE 試劑盒及小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素22（interleukin-22，IL-22）、IL-17 和IL-10 ELISA 試劑盒（上海生工）。轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；熒光顯微鏡（Olympus）；多功能酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀（BioTek）；切片機（Leica）。

2 方法

2.1 模型的制備及分組 將小鼠隨機分為4 組，每組10 只。正常組連續(xù)2 d 每日經(jīng)鼻滴入100 μL 空白培養(yǎng)基上清，每日腹腔注射10 mL/kg 0.5% CMC-Na溶液，共7 d。BC 組連續(xù)2 d 每日經(jīng)鼻滴入100 μL 病毒培養(yǎng)基上清［9］，每日腹腔注射10 mL/kg 0.5%CMC-Na 溶液，共7 d。黃芩苷組連續(xù)2 d 每日經(jīng)鼻滴入100 μL 病毒培養(yǎng)基上清，每日腹腔注射10 mL/kg黃芩苷混懸液（按200 mg/kg 的劑量［8］溶于0.5%CMC-Na 溶液），共7 d。BC+黃芩苷+Jagged1 組連續(xù)2 d每日經(jīng)鼻滴入100 μL病毒培養(yǎng)基上清，每日腹腔注射10 mL/kg黃芩苷和Jagged1的混懸液（按200 mg/kg 黃芩苷+1 mg/kg Jagged1 的劑量溶于0.5% CMCNa 溶液），共7 d。末次給藥24 h 后，取肺組織，左肺組織用于病毒滴度測定、炎癥因子及蛋白表達檢測，右肺組織部分用于流式細(xì)胞術(shù)分析，部分浸入4%多聚甲醛中固定制作組織切片。

2.2 HE 染色 將2.1 中右肺切片（4 μm），遵循試劑盒說明分別與蘇木素染液和伊紅染液孵育后，光鏡下觀察并進行病理學(xué)評分。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 采用Percoll 液分離2.1 中右肺組織單個核細(xì)胞，用流式緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×109L-1，取100 μL 加入流式管，與抗CD4-APC和IL-17-PE 單抗避光孵育20 min，取400 μL 上流式細(xì)胞儀進行檢測，設(shè)門CD4 和IL-17 檢測Th17 細(xì)胞數(shù)量，即CD4+IL-17+；另外與CD4-FITC、CD25-PE 和FOXP3-APC 單抗避光孵育20 min，設(shè)門CD4、CD25和FOXP3檢測Treg數(shù)量，即CD4+CD25+FOXP3+。

2.4 空斑實驗 取100 mg 左肺組織按照1 g/mL 的比例加入RPMI-1640 培養(yǎng)液制備勻漿液，取上清液接種于HeLa 細(xì)胞，孵育60 min 后，棄去上清，加入含有1.5% CMC-Na 的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育7 d，用0.1%的結(jié)晶紫溶液染色后計數(shù)空斑數(shù)量，以此表示肺組織中病毒滴度。

2.5 Western blot 實驗 取100 mg 左肺組織，使用RIPA 緩沖液裂解后離心，保存上清液并用BCA 法定量蛋白濃度。每組取30 μg蛋白煮沸后上樣電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜并用5%脫脂奶粉封閉，然后分別與Ⅰ抗［Hes1（1∶300）、Hey2（1∶250）、activated Notch1（1∶500）、RORγt（1∶250）、FOXP3（1∶500）和β-actin（1∶500）］4 ℃過夜反應(yīng)，洗膜3 次后，在室溫下與Ⅱ抗（1∶1 000）反應(yīng)1 h，加入ECL 顯影1 min，放入TANON成像系統(tǒng)曝光并拍照分析。

2.6 ELISA 取100 mg左肺組織，加入預(yù)冷的PBS，勻漿、離心后保留上清液，遵循TGF-β、IL-22、IL-17和IL-10 ELISA 試劑盒說明依次加入相應(yīng)試劑，在酶標(biāo)儀上檢測各組在450 nm處的吸光度（A），參考標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組樣品中TGF-β、IL-22、IL-17和IL-10水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24 和GraphPad Prism 8.0 行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩苷對小鼠肺組織的影響

正常組肺組織形態(tài)正常，肺泡壁間隔均勻，未見血管破裂；BC 組肺泡壁和肺泡間隙可見較多炎癥浸潤，肺泡壁增寬和血管破壞，病理評分明顯高于正常組（P＜0.05）；黃芩苷治療可減輕上述組織損傷，病理評分明顯降低（P＜0.05）；而Notch 激活劑Jagged1 可逆轉(zhuǎn)黃芩苷的改善作用，見圖1、表1。

Figure 1. Morphological Observation of lung tissue in mice（HE staining）.圖1 小鼠肺組織形態(tài)觀察

2 黃芩苷對小鼠肺組織RSV載量的影響

正常組未檢測到RSV；BC 組肺組織RSV 載量為（10.53±2.81）×104PFU/（g tissue）；黃芩苷治療后肺組織RSV 載量降低至（4.72±1.43）×104PFU/（g tissue），顯著低于BC 組（P＜0.05）；而BC+黃芩苷+Jagged1 組RSV 載量顯著高于BC+黃芩苷組（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠肺組織病理評分及RSV載量Table 1. Pathological score and RSV load of lung tissue in mice（Mean±SD. n=10）

3 黃芩苷對小鼠肺組織Th17 和Treg 細(xì)胞比例及其細(xì)胞因子水平的影響

與正常組相比，BC 組Th17 細(xì)胞比例及IL-17 和IL-22水平升高，Treg細(xì)胞比例及IL-10和TGF-β水平降低（P＜0.05）；與BC 組相比，BC+黃芩苷組Th17 細(xì)胞比例及IL-17 和IL-22 水平降低，Treg 細(xì)胞比例及IL-10 和TGF-β 水平升高（P＜0.05）；與BC+黃芩苷組相比，BC+黃芩苷+Jagged1 組Th17 細(xì)胞比例及IL-17和IL-22 水平升高，Treg 細(xì)胞比例及IL-10 和TGF-β水平降低（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 小鼠肺組織Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例及其細(xì)胞因子水平的比較Table 2. Comparison of Th17 proportion，Treg proportion and their cytokine levels in lung tissues of the mice（Mean±SD. n=10）

Figure 2. Proportion of Th17 and Treg cells in lung tissue of mice detected by flow cytometry.圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺組織Th17和Treg細(xì)胞的比例

4 黃芩苷對小鼠肺組織FOXP3、RORγt 和Notch通路蛋白表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，BC 組的FOXP3 蛋白水平降低，RORγt 蛋白水平升高（P＜*P＜0.05vsnormal group；#P＜0.05vsBC group；△P＜0.05vsBC+baicalin group.0.05）；與BC 組相比，BC+黃芩苷組的FOXP3 蛋白水平水平升高，RORγt蛋白水平降低（P＜0.05）；與BC+黃芩苷組相比，BC+黃芩苷+Jagged1 組的FOXP3 蛋白水平水平降低，RORγt 蛋白水平升高（P＜0.05）。與 正 常 組 相 比，BC 組 的activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平升高（P＜0.05）；與BC 組相比，BC+黃芩苷組的activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平降低（P＜0.05）；與BC+黃芩苷組相比，BC+黃芩苷+Jagged1 組的activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖3。

Figure 3. Effect of baicalin on the expression of FOXP3，RORγt and Notch pathway-related proteins. A：normal group；B：BC group；C：BC+baicalin group；D：BC+baicalin+Jagged1 group. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs A；#P＜0.05 vs B；△P＜0.05 vs C.圖3 黃芩苷對FOXP3、RORγt和Notch通路相關(guān)蛋白表達的影響

討 論

在受到外源性病毒感染后，機體的T 細(xì)胞可識別病毒抗原，激活抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性反應(yīng)，進而控制病毒感染，CD4+T 細(xì)胞在該過程中發(fā)揮協(xié)調(diào)作用。T細(xì)胞受體被激活后，CD4+T細(xì)胞進一步分化為Th1、Th2、Th17 和Treg 等細(xì)胞亞群，目前研究已確定Th17/Treg 失衡在病毒感染類疾病中發(fā)揮重要作用［10］。

Th17 細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子為RORγt，可分泌IL-17 和IL-22 等，在RSV 感染期間可誘導(dǎo)黏液產(chǎn)生，增強Th2 應(yīng)答，刺激肺嗜中性粒細(xì)胞浸潤，抑制CD8+T 細(xì)胞對病毒的清除，促進RSV 所誘導(dǎo)的呼吸道炎癥和功能障礙，在BC 患兒疾病進展中發(fā)揮促進作 用［11］。而Treg 細(xì) 胞 可 拮 抗Th17 細(xì) 胞 的 功 能，F(xiàn)OXP3 為誘導(dǎo)其分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可通過分泌TGF-β 和IL-10 等抑炎因子，減輕炎癥浸潤，促進病毒清除，避免過度先天和細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制Th2 應(yīng)答，在抵抗胞外病原體入侵和抑制自身免疫中起著保護作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷治療后BC 小鼠肺組織炎性浸潤、肺泡壁增寬等損傷減輕，且Th17 細(xì)胞比例、IL-17、IL-22 水平及RORγt 蛋白水平明顯降低，Treg 細(xì)胞比例、IL-10、TGF-β 水平及FOXP3 蛋白水平明顯增高。Mangodt 等［13］指出，從Treg 向Th17轉(zhuǎn)化具有可塑性，RSV 感染期間，肺部Th17 比例升高，Treg 降低，導(dǎo)致病毒清除延遲和疾病嚴(yán)重性增加。因此，調(diào)控Th17/Treg 平衡可能有利于RSV 的清除。我們的研究提示黃芩苷在調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞分化中發(fā)揮作用，與蔡志波等［14］研究一致。Pang等［15］研究認(rèn)為，黃芩苷通過下調(diào)RLRs 信號通路，降低Th1/Th2 和Th17/Treg 比例，控制甲型流感病毒感染并改善預(yù)后。本研究推測，黃芩苷通過上調(diào)FOXP3 表達促進Treg 細(xì)胞分化，并下調(diào)RORγt 表達抑制Th17 分化，進而促進CD8+T 細(xì)胞對RSV 的清除［8］，減輕BC小鼠呼吸道炎癥。

Notch 通路是重要的信號傳導(dǎo)途徑，可以通過抑制細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)并維持免疫平衡。Notch 通路在CD4+T 細(xì)胞分化為Th17 和Treg 細(xì)胞及二者相互轉(zhuǎn)化中起重要調(diào)節(jié)作用［16］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，BC 組activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平升高，采用黃芩苷治療后，BC 小鼠肺組織activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平均明顯降低，趨于正常組。臨床證據(jù)表明，在過敏性哮喘患兒中，Notch 蛋白高表達且Th17/Treg 比例升高；在支原體肺炎患兒中，Notch 通路蛋白Notch1 和Hes1 及Th17/Treg 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 和RORγt 均高表達，Th17細(xì)胞、Th17/Treg 比例增高，Treg 細(xì)胞比例較低［17-18］。Qin等［19］發(fā)現(xiàn)，在RSV感染的模型動物肺組織中存在Notch 通路活化，并伴有高水平的Th17 分化，認(rèn)為Notch1 通路的活化誘導(dǎo)了氣道微環(huán)境中CD4+T 細(xì)胞向Th17 分化，從而導(dǎo)致RSV 相關(guān)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。而靶向Notch 通路的抑制劑可通過抑制Th17 反應(yīng)，增加Treg分化，減輕RSV 所致氣道高反應(yīng)性和肺部炎癥［20-21］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對BC 小鼠的改善作用及對Th17/Treg 比例的調(diào)節(jié)作用可被Notch1 激活劑阻斷，因此，推測黃芩苷可能通過對Notch通路的抑制而發(fā)揮對BC小鼠的治療作用。

綜上所述，黃芩苷可能通過Notch 通路糾正Th17/Treg失衡來發(fā)揮對BC的治療作用，進一步豐富了其藥理機制。然而其它通路也可能在該過程中發(fā)揮作用，有待繼續(xù)探究。