TNF-α、IL-6、IL-17在胎膜早破母兒感染相關(guān)不良妊娠結(jié)局中的表達(dá)及臨床價值

趙 倩，何 霞，凌 婭，可饒陽，李賽男，黃 蓉，祁文瑾

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，云南 昆明 650032）

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指在臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生自然破裂導(dǎo)致羊膜腔與外界相通，羊水持續(xù)滲漏。在PROM疾病進(jìn)展過程中感染和炎癥反應(yīng)與胎膜破裂互為因果，一半以上的PROM患者中存在羊膜內(nèi)炎癥[1-2]。臨床工作中PROM合并絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CS）早期癥狀及常用實驗室指標(biāo)變化不明顯，一般是在出現(xiàn)產(chǎn)婦發(fā)熱和母胎心動過速等臨床體征時才引起關(guān)注，易延誤診斷及最佳治療時期。妊娠期多種生物途徑導(dǎo)致子宮NK細(xì)胞活化和T細(xì)胞特異性亞群的發(fā)育，表現(xiàn)為妊娠期獨(dú)特的免疫改變：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量增高，Th17數(shù)量減少，Th1細(xì)胞因子分泌減少，Th2細(xì)胞因子分泌增多。PROM發(fā)生時Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡打破，相關(guān)譜系的細(xì)胞因子表達(dá)改變[3-4]，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-17分別為Th1、Th2、Th17細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子。本研究通過檢測母血、臍血中TNF-α、IL-6、IL-17細(xì)胞因子在正常妊娠、PROM、PROM合并CS、PROM新生兒圍產(chǎn)期感染孕婦中的水平變化，探討以上細(xì)胞因子在PROM母兒感染相關(guān)并發(fā)癥中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

選取2019年1月至2020年11月于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科分娩的51例PROM孕婦為觀察組，同期20例正常分娩孕婦為對照組。將觀察組分為PROM無CS組（n=33）和PROM合并CS組（n=18）。觀察組中10例PROM患者新生兒娩出后轉(zhuǎn)至昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院NICU并確診為新生兒感染者（新生兒敗血癥4例、新生兒肺炎3例、新生兒真菌感染1例、新生兒腸炎2例）歸為A2組（n=10），其余PROM患者未發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染者歸為A1組（n=41）。PROM及臨床CS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]，PROM診斷：臨產(chǎn)前出現(xiàn)陰道流液或外陰濕潤，窺陰器檢查見羊水自宮頸口流出或后穹窿液池形成；陰道液測pH≥6.5；陰道液涂片見羊齒狀結(jié)晶，出現(xiàn)上述任何一項可確診PROM。臨床CS診斷：（1）孕婦體溫≥38.0 ℃；（2）陰道分泌物異味，羊水惡臭；（3）胎兒心率基線≥160次/分或母親心率≥100 次/分；（4）孕婦外周血白細(xì)胞計數(shù)≥15×109/L；（5）子宮呈激惹狀態(tài)，宮體有壓痛。孕婦體溫升高結(jié)合以上其他任何1項陽性體征可診斷為臨床CS。產(chǎn)婦分娩后胎盤組織以HE染色法驗證組織學(xué)CS[6]：絨毛膜、羊膜、臍帶任一處組織中出現(xiàn)每高倍鏡視野中有中性粒細(xì)胞浸潤≥5個。新生兒圍產(chǎn)期感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第五版《實用新生兒學(xué)》（P510、P531、P582、P622）[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：本研究獲得醫(yī)院倫理委員會倫理批準(zhǔn)，受試對象對此研究知情同意。2組孕婦均不伴任何孕前基礎(chǔ)疾病及其他妊娠并發(fā)癥，年齡在 20～35 歲，單胎妊娠，入院未臨產(chǎn)，產(chǎn)檢資料完整。利用Pass軟件計算機(jī)模擬統(tǒng)計效率確定樣本含量。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的制備2組孕婦均在入院時（胎膜破裂12 h內(nèi)）抽取肘靜脈血3 mL、胎兒娩出后采集臍靜脈血3 mL，將采集的血液標(biāo)本分別裝于普通無菌干燥試管中，4 ℃條件下待其自然凝固，于3 000 r/min離心20 min后留取血清于-80 ℃冰箱保存，集中測定母血及臍血血清TNF-α、IL-6、IL-17。研究對象胎盤組織以10%甲醛固定送檢病理科。

1.2.2 主要試劑及檢測方法人TNF-α、IL-6、IL-17定量ELISA試劑盒檢測母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17表達(dá)水平（欣博盛科技生物有限公司）。胎盤組織石蠟包埋、HE染色后由高年資醫(yī)生專人負(fù)責(zé)閱片檢查組織學(xué)絨毛膜羊膜炎。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，符合非正態(tài)分布的計量資料采用M（P25，P75）表示；組間差異比較：計量資料滿足正態(tài)分布的連續(xù)型變量2組間比較采用t檢驗，2組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布2組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗，2組間比較采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis H檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗；母血臍血各因子之間表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析；采用MedCalc軟件對單項指標(biāo)直接繪制受試者工作特征（receiver 0perating characteristic，ROC）曲線，聯(lián)合檢測時先以Logistics回歸計算出相關(guān)聯(lián)合指標(biāo)的回歸方程及聯(lián)合預(yù)測概率，再將聯(lián)合預(yù)測概率繪制ROC曲線計算聯(lián)合指標(biāo)的診斷價值。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般情況

2組產(chǎn)婦年齡、孕次、孕前BMI值、孕期增重、入院體溫、新生兒出生Apgar評分、新生兒臍動脈pH值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 研究對象臨床資料比較（）Tab.1 Comparation of clinical information between study objects（）

表1 研究對象臨床資料比較（）Tab.1 Comparation of clinical information between study objects（）

2.2 母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17在對照組、PROM無CS組與PROM合并CS組間表達(dá)水平比較

PROM合并CS組母血、臍血血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于PROM無CS組和對照組（P＜ 0.05）；PROM無CS組母血TNF-α、臍血IL-6的表達(dá)水平高于對照組（P＜ 0.05）；2組間母血、臍血IL-17無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05），見表2。

表2 對照組、PROM無CS組、PROM合并CS組母血、臍血各因子表達(dá)水平比較Tab.2 Comparation of various cytokine expression levels in maternal serum and umbilical cord serum between the control group，PROM without CS group and PROM with CS group

2.3 母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17的在對照組、A1組和A2組間表達(dá)水平比較

PROM組中未發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染者為A1組，PROM發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染者為A2組，A2組母血、臍血血清TNF-α、IL-6和IL-17表達(dá)水平均高于A1組和對照組（P＜ 0.05）；A1組母血TNF-α、臍血IL-6的表達(dá)水平高于對照組（P＜ 0.05）；見表3。

表3 對照組、A1、A2組母血、臍血各因子表達(dá)水平比較Tab.3 Comparation of various cytokine expression levels in maternal serum and umbilical cord serum between the control group，A1 group and A1 group

2.4 TNF-α、IL-6及IL-17的Spearman等級相關(guān)性分析

母血、臍血血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)，見表4。

表4 各細(xì)胞因子在母血、臍血中的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of each cytokine in maternal serum with it in umbilical cord serum

2.5 各因子表達(dá)水平的ROC曲線分析

2.5.1 母血、臍血TNF-α、IL-6診斷PROM合并CS的ROC曲線分析比較各因子單項及聯(lián)合檢測診斷PROM合并CS的AUC可見：單項檢測時，母血TNF-α的AUC最大（0.763），母血TNF-α的AUC高于臍 血TNF-α（0.614）（P＜0.05）；聯(lián)合母血或臍血中TNF-α+IL-6兩項指標(biāo)診斷PROM合并CS的AUC與母血、臍血中單項指標(biāo)檢測相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）；聯(lián)合母血+臍血TNF-α+IL-6 4項指標(biāo)診斷PROM合并CS的AUC（0.820）顯著高于臍血TNF-α單項指標(biāo)的AUC值（0.614）（P＜ 0.05），此外聯(lián)合母血+臍血TNF-α+IL-6四項指標(biāo)診斷PROM合并CS的AUC與其他單獨(dú)或聯(lián)合檢測指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表5,圖1。

圖1 母血、臍血TNF-α、IL-6診斷PROM合并CS的ROC曲線Fig.1 ROC curve of TNF-α and IL-6 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

表5 母血、臍血TNF-α、IL-6診斷PROM合并CS的ROC曲線Tab.5 ROC curve of TNF-α and IL-6 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

2.5.2 母血、臍血TNF-α、IL-6和IL-17預(yù)測PROM發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染的ROC曲線分析比較各因子單項及聯(lián)合檢測預(yù)測PROM發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染的AUC可見：單項檢測時，母血中IL-6的AUC最大（0.800），臍血中IL-17的AUC最大（0.829），臍血IL-17的AUC高于母血IL-17（0.735）（P＜ 0.05）；聯(lián)合母血、臍血中AUC較大兩項單項指標(biāo)（母血TNF-α+IL-6、臍血IL-6+IL-17），母血、臍血各三項指（TNF-α+IL-6+IL-17）以及母血+臍血TNF-α+IL-6+IL-17 6項指標(biāo)診斷PROM發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染的AUC與母血、臍血中單項指標(biāo)單獨(dú)檢測相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）；但聯(lián)合臍血IL-6+IL-17 2項指標(biāo)以及聯(lián)合臍血TNF-α+IL-6+IL-17 3項指標(biāo)診斷PROM發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染的AUC較大（0.863、0.866），診斷效果較好，見表6,圖2。

圖2 母血、臍血TNF-α、IL-6和IL-17診斷PROM新生兒圍產(chǎn)期感染的ROC曲線Fig.2 ROC curve of TNF-α，IL-6 and IL-17 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with neonatal infection during perinatal

表6 母血、臍血TNF-α、IL-6和IL-17診斷PROM發(fā)生新生兒圍產(chǎn)期感染的ROC曲線Tab.6 ROC curve of TNF-α，IL-6 and IL-17 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

3 討論

TNF-α屬于Th-1類細(xì)胞因子，是一種多向性的促炎細(xì)胞因子，胎盤處可由活化的CD4+T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞，NK 細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生。PROM相關(guān)的凋亡途徑可以通過TNF-α受體/fas或P53/Bax介導(dǎo)的途徑發(fā)生[8-9]人類胎膜組織的體外研究證明[10-11]：TNF-α也許是能使基質(zhì)金屬蛋白（matrix metalloproteinases，MMPs）激活的最強(qiáng)介質(zhì)，而MMPs可通過調(diào)節(jié)胎膜組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白代謝的方式促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原的降解，從而導(dǎo)致胎膜的破裂。

IL-6屬于Th-2類細(xì)胞因子，也可由Th0細(xì)胞、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞釋放，是gp130細(xì)胞因子家族中的一種多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)急性期反應(yīng)、參與先天免疫轉(zhuǎn)變?yōu)楂@得性免疫的過渡調(diào)節(jié)。羊水中IL-6的濃度被證明是羊膜內(nèi)炎癥的可靠生物標(biāo)志物，足月絨毛膜性羊膜炎婦女羊水中的IL-6濃度與流式細(xì)胞術(shù)獲得的總白細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量正相關(guān)[12]；同樣，在未足月PROM患者中IL-6濃度也與羊水中的中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān)[13]。

Th17和Treg 細(xì)胞是兩種在免疫反應(yīng)中起重要作用的 CD4+T淋巴細(xì)胞亞型，可橋接適應(yīng)性免疫反應(yīng)和先天性免疫反應(yīng)，其中Th17細(xì)胞能分泌IL-17參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病原微生物感染免疫應(yīng)答以及自身免疫性疾病等過程。體外研究[14]發(fā)現(xiàn)IL-17可通過激活活性氧/核因子kB（ROS/NF-κB）信號途徑的方式誘導(dǎo)MMP-2/MMP-9的表達(dá)引發(fā)胎膜破裂。

本研究結(jié)果顯示PROM合并CS組母血和臍血血清TNF-α、IL-6水平均顯著高于PROM無CS組及對照組，PROM新生兒圍產(chǎn)期感染者母血、臍血血清TNF-α、IL-6、IL-17 3者水平也均高于PROM無新生兒圍產(chǎn)期感染組和對照組，PROM無母兒感染相關(guān)不良妊娠并發(fā)癥者母血TNF-α、臍血IL-6水平均顯著高于對照組。研究表明，當(dāng)PROM合并感染時，細(xì)菌產(chǎn)物可促進(jìn)MMPs的激活從而使膠原蛋白降解，細(xì)菌激活的天然免疫反應(yīng)可使包括TNF-α、IL-6在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子、趨化因子等激活[15]，血清中單獨(dú)升高的IL-17發(fā)揮的促炎效果不明顯，但I(xiàn)L-17與其他促炎細(xì)胞因子如TNF-α，IL-1β，IL-22，干擾素-γ和粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞集落刺激因子同時產(chǎn)生可引發(fā)血清IL-6和IL-8水平升高，促進(jìn)大量活化中性粒細(xì)胞的募集到炎癥部位，從而放大中性粒細(xì)胞的促炎反應(yīng)[16]。

本研究母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17分別呈顯著正相關(guān)，提示臨床工作中，在分娩前若考慮到臍血標(biāo)本采集的局限性僅檢測母血TNFα、IL-6、IL-17可有效體現(xiàn)出臍血中的相關(guān)因子的水平，反應(yīng)胎兒的炎癥水平。而胎兒娩出后抽取臍靜脈血檢測以上指標(biāo)也可先于病檢一步輔助診斷CS和預(yù)測未來的新生兒圍產(chǎn)期感染。

ROC曲線分析提示，在預(yù)測PROM母兒感染相關(guān)不良妊娠結(jié)局時母血TNF-α的預(yù)測價值優(yōu)于臍血，臍血IL-17的預(yù)測價值優(yōu)于母血；猜測TNF-α可能參與了PROM母體的感染及炎癥反應(yīng)，當(dāng)感染及炎癥進(jìn)一步影響到胎兒并導(dǎo)致將來發(fā)生的新生兒圍產(chǎn)期感染時即促發(fā)了胎兒IL-17的產(chǎn)生，IL-17又進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生增多。這與Rito Daniel等[17]的研究相似：暴露于組織學(xué)絨毛膜羊膜炎的早產(chǎn)兒的Th17型免疫反應(yīng)增強(qiáng)。本研究提示IL-17有望成為預(yù)測PROM新生兒圍產(chǎn)期感染的新指標(biāo)。同時發(fā)現(xiàn)，多項指標(biāo)聯(lián)合檢測的臨床價值較好，在臨床工作中運(yùn)用時可能具有較好的真實性和實用性。

TNF-α、IL-6可能參與了PROM母體感染的發(fā)生發(fā)展，對預(yù)測PROM合并CS具備一定的臨床意義，而IL-17可能參與了胎兒宮內(nèi)感染過程，當(dāng)PROM患者TNF-α、IL-6、IL-173項指標(biāo)同時升高時，須警惕嚴(yán)重的胎兒宮內(nèi)感染，臨床工作可盡快終止妊娠、加快產(chǎn)程、加強(qiáng)抗感染治療、積極做好新生兒復(fù)蘇準(zhǔn)備以及兒科醫(yī)生陪同分娩及早做好新生兒轉(zhuǎn)科治療準(zhǔn)備。