TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ在盆腔器官脫垂患者陰道壁中的表達(dá)及意義

李志紅，胡 勇，熊正花，龍熙翠，盧紹波，韓雪松

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，云南 昆明 650032）

盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）是一種中老年女性常見的健康問題，我國(guó)的全國(guó)多中心橫斷面調(diào)查結(jié)果提示，癥狀性POP占成年女性的9.6%[1]，其主要的癥狀為陰道口脫出物，可伴有下腹墜脹、排尿異常、排便異常和性功能障礙等，不僅影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)導(dǎo)致焦慮、抑郁、自我孤立和自卑等影響身心健康[2-3]，造成了一系列的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問題[4]。

POP主要是由于盆底支持結(jié)構(gòu)的薄弱進(jìn)而導(dǎo)致的盆腔器官的位置下降及功能的異常，盆底的支持結(jié)構(gòu)主要由盆底肌肉、韌帶和骨盆內(nèi)筋膜組成。這些支持結(jié)構(gòu)主要由結(jié)締組織組成，膠原蛋白是盆底結(jié)締組織的主要成分。有學(xué)者認(rèn)為，盆底結(jié)締組織（子宮骶韌帶和主韌帶結(jié)締組織）的改變可能在POP的發(fā)病機(jī)制中起著潛在的作用[5-6]。也有研究表明POP的發(fā)生與盆底結(jié)締組織（如子宮骶韌帶、主韌帶）中的膠原含量減少，膠原類型比率改變，膠原形態(tài)特征改變密切相關(guān)[7-8]。POP的病理改變可能從分子膠原水平開始，為了進(jìn)一步探索膠原含量及膠原代謝異常與POP的關(guān)系，本研究采用免疫組化的方法檢測(cè)陰道壁組織中TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的表達(dá)，探討TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ與POP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為POP的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年05月至2020年12月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院部符合納入標(biāo)準(zhǔn)的POP患者28例為實(shí)驗(yàn)組，其中按POP-Q分期法將其分為：Ⅱ度7例，Ⅲ度16例，Ⅳ度5例。選擇同期因婦科良性病變行全子宮和（或）雙附件切除且無POP患者陰道壁組織30例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷符合第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》中盆腔器官脫垂定量分期法[9]（pelvic organ prolapse quantitation，POP-Q）分期≥Ⅱ度的患者；（2）進(jìn)行手術(shù)治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前3個(gè)月內(nèi)服用雌激素類藥物；（2）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀旁腺功能亢進(jìn)和甲狀腺功能亢進(jìn)影響膠原代謝的疾病者；（3）術(shù)后病檢為子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜不典型增生與雌激素密切相關(guān)疾病者；（4）惡性腫瘤患者；（5）臨床病例資料不全者。本次研究所有患者均知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)

通過免疫組化法檢測(cè)陰道壁組織中CollagenⅢ、MMP-1、TIMP-1及TGF-β1的表達(dá)，采用四級(jí)分級(jí)法進(jìn)行判讀。并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及分析，比較POP組與對(duì)照組陰道壁組織中Collagen Ⅲ、TIMP-1及TGF-β1的表達(dá)差異；分析POP組陰道壁組織中Collagen Ⅲ、TIMP-1及TGF-β1的表達(dá)與POP臨床分期的關(guān)系；分析POP組陰道壁組織中Collagen Ⅲ、TIMP-1及TGF-β1三者之間的表達(dá)是否存在相關(guān)性。

1.3 方法

POP組將POP患者術(shù)后廢棄陰道壁上切取一大小約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織，對(duì)照組在術(shù)后離體子宮上附著的陰道壁上切取一大小約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm 的組織。將切取的新鮮的陰道壁組織標(biāo)本放入甲醛液中固定。主要步驟為：（1）石蠟包埋、切片；（2）石蠟切片脫蠟；（3）水化；（4）抗原修復(fù)；（5）阻斷；（6）滴加Ⅰ抗（TGF-β1抗體效價(jià)1∶500；TIMP-l抗體效價(jià)1∶1 000；Collagen Ⅲ抗體效價(jià)1∶400，TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ購自abcam公司）孵育過夜；（7）沖洗后滴加二抗（羊抗兔IgG-HRP抗體效價(jià)1∶1 000，二抗購自北京索萊寶生物科技有限公司），室溫下孵育30 min；（8）DAB顯色（將原液與稀釋液1∶50配比搖勻）；（9）復(fù)染胞核，分化，透明，封片；（10）顯微鏡下閱片。

判讀標(biāo)準(zhǔn)：本研究采用Remmele等[10]提出的兼顧陽性染色的強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比四級(jí)分級(jí)法進(jìn)行判讀。在顯微鏡視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察其染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比，得出免疫組化反應(yīng)評(píng)分（immunoreactive score，IRS），取10個(gè)視野下的IRS平均值為最終IRS得分。IRS=染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比得分。（1）按陽性染色強(qiáng)度判定：根據(jù)著色的情況給予其0～3分，無著色：0分，染色呈淡黃色：1分，染色呈黃色：2分，染色呈棕黃色或棕褐色：3分；（2）按陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比率判定：陽性著色呈淡黃色、黃色、棕黃色及棕褐色，根據(jù)陽性細(xì)胞比率給予0～4分，無陽性細(xì)胞：0分，陽性細(xì)胞百分比≤10%：1分；陽性細(xì)胞百分比11%～30%：2分；陽性細(xì)胞百分比31%～70%：3分，陽性細(xì)胞百分比71～100%：4分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布用表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較選擇單因素ANOVA檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布用M（P25，P75）表示，組間比較用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般情況

POP組與對(duì)照組在年齡、BMI、絕經(jīng)情況、產(chǎn)次因素比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 2組研究對(duì)象的基本特征對(duì)比[（）/n（%）/M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of basic characteristics of the two groups of research objects[（）/n（%）/M（P25，P75）]

表1 2組研究對(duì)象的基本特征對(duì)比[（）/n（%）/M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of basic characteristics of the two groups of research objects[（）/n（%）/M（P25，P75）]

2.2 2組陰道壁組織中TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性著色呈淡黃色、黃色、棕黃色及褐色。POP組陰道壁組織TGFβ1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的IRS得分均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表2、圖1。

表2 2組TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的表達(dá)情況（）Tab.2 The expression of TGF-β1，TIMP-1 and Collagen Ⅲ between the two groups（）

表2 2組TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的表達(dá)情況（）Tab.2 The expression of TGF-β1，TIMP-1 and Collagen Ⅲ between the two groups（）

*P ＜ 0.05。

2.3 POP組陰道壁組織中TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系

POP組中Ⅳ度的TGF-β1、TIMP-1及CollagenⅢ的IRS得分明顯低于Ⅱ度、Ⅲ度的POP患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），Ⅲ度的TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的IRS得分明顯低于Ⅱ度的POP患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表3～5。

表3 POP組TGF-β1的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系（）Tab.3 The relationship between the expression of TGF-β1 and POP-Q stage in POP group（）

表3 POP組TGF-β1的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系（）Tab.3 The relationship between the expression of TGF-β1 and POP-Q stage in POP group（）

*P ＜ 0.05。

2.4 POP組陰道壁組織TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ表達(dá)相關(guān)性

POP組陰道壁組織中Collagen Ⅲ與TIMP-1的呈正相關(guān)（r=0.375，P＜ 0.05），TGF-β1表達(dá)與Collagen Ⅲ呈正相 關(guān)（r=0.401，P＜ 0.05），TGF-β1表達(dá)與TIMP-1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.397，P＜ 0.05），見圖2～4。

圖2 POP組Collagen Ⅲ與TIMP-1的關(guān)系Fig.2 The relationship between collagen Ⅲ and TIMP-1 in the POP group

表4 POP組TIMP-1的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系（）Tab.4 The relationship between the expression of TIMP-1 and POP-Q stage in POP group（）

表4 POP組TIMP-1的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系（）Tab.4 The relationship between the expression of TIMP-1 and POP-Q stage in POP group（）

*P ＜ 0.05。

表5 POP組Collagen Ⅲ的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系（）Tab.5 The relationship between the expression of collagenⅢ and POP-Q stage in POP group（）

表5 POP組Collagen Ⅲ的表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系（）Tab.5 The relationship between the expression of collagenⅢ and POP-Q stage in POP group（）

*P ＜ 0.05。

圖3 POP組Collagen Ⅲ與TGF-β1的關(guān)系Fig.3 The relationship between collagen Ⅲ and TGF-β1 in the POP group

圖4 POP組TIMP-1與TGF-β1的關(guān)系Fig.4 The relationship between TIMP-1 and TGF-β1 in the POP group

3 討論

POP是由盆底支持結(jié)構(gòu)因退化、損傷等導(dǎo)致薄弱，進(jìn)而發(fā)生盆腔器官的位置異常及功能異常。盆腔器官在正常解剖位置的維持，在分子水平上與盆腔支持組織的成分密切相關(guān)。盆底結(jié)締組織是盆腔支持組織的主要成分，盆底結(jié)締組織由細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分組成，ECM包括：膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖等，其中膠原蛋白是ECM的主要成份。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transform growth factor β-1，TGF-β1）是多種細(xì)胞外基質(zhì)成分和酶的主要調(diào)節(jié)因子，其能促進(jìn)膠原蛋白的合成及抑制ECM的降解，從而維持盆底結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)及功能[11]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組含Zn2+的蛋白水解酶，能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMPs的特異性抑制劑，在所有MMPs抑制劑中作用最為廣泛，能與大多數(shù)MMPs結(jié)合形成復(fù)合物（比例1∶1），抑制MMPs的活性，阻止MMPs與其底物細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合，從而抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，維持正常結(jié)締組織中膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分的動(dòng)態(tài)平衡，維持盆底結(jié)締組織的完整性。Ⅲ膠原蛋白（Collagen Ⅲ）是人類盆底結(jié)締組織中的主要膠原亞型之一，其構(gòu)成陰道壁、韌帶、筋膜等盆底結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)骨架，同時(shí)也賦予這些盆底結(jié)締組織強(qiáng)度及張力[12]，維持著正常的盆底功能[13]。本研究結(jié)果顯示，POP組的Collagen Ⅲ的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。本研究結(jié)果與Liu及Zeng等[14-15]的研究結(jié)果一致。提示Collagen Ⅲ含量的降低在POP的發(fā)生中起著重要作用。其發(fā)生的切確機(jī)制尚不清楚，可能是由于：一方面，CollagenⅢ含量的減少，使得盆腔器官的支持組織（韌帶、筋膜及陰道壁等）的強(qiáng)度及彈性降低導(dǎo)致POP的發(fā)生。另一方面，膠原含量的降低會(huì)刺激機(jī)體代償性的修復(fù)，膠原蛋白直徑增加，膠原纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂[16]，使得盆底支持組織的順應(yīng)性下降導(dǎo)致POP的發(fā)生。由此推測(cè)，女性盆底支持組織因損傷或退化等因素，Collagen Ⅲ含量減少及膠原含量的較少可能刺激膠原纖維代償性修復(fù)，從而使得膠原蛋白結(jié)構(gòu)及功能的異常，進(jìn)而導(dǎo)致盆底支持組織的薄弱和POP的發(fā)生。本研究進(jìn)一步探索調(diào)節(jié)膠原蛋白的調(diào)節(jié)因子TGF-β1、TIMP-1的表達(dá)，結(jié)果顯示POP組的TGF-β1、TIMP-1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示TGF-β1、TIMP-1可能參與了POP的發(fā)生，由此推測(cè)，在 POP發(fā)病機(jī)制中可能存在因盆底支持組織中TGF-β1、TIMP-1表達(dá)下降，從而使得膠原代謝的紊亂，膠原蛋白含量降低，導(dǎo)致盆底支持組織薄弱和POP的發(fā)生。這可能與TGF-β1、TIMP-1調(diào)節(jié)膠原蛋白代謝的多種病理生理過程有關(guān)[17]，其包括：（1）TGF-β1可能通過下調(diào)MMPs和（或）上調(diào)TIMPs來促進(jìn)膠原合成和減少降解，TGF-β1表達(dá)的減輕了其對(duì)MMPs活性的抑制，MMPs活性增加，膠原降解增加導(dǎo)致膠原含量的減少，使得盆底支持組織的薄弱。此外，TGF-β1可以提高成纖維細(xì)胞膠原mRNA的水平，從而使膠原基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控，TGF-β1在組織的成纖維細(xì)胞內(nèi)能增強(qiáng)脯氨酸強(qiáng)化，使產(chǎn)生的原膠原分子更穩(wěn)定難以降解；（2）TIMP-1表達(dá)的減少，對(duì)MMPs活性的抑制作用減少，導(dǎo)致膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成份降解增加，導(dǎo)致盆底支持組織薄弱。

本研究進(jìn)一步分析了POP組陰道壁組織中TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ表達(dá)與POP-Q分期的關(guān)系，可見隨著臨床分期的增加，在Ⅱ度、Ⅲ度及Ⅳ度POP患者陰道壁組織中TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ的表達(dá)逐漸降低。研究表明TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ與病情程度有一定的關(guān)系，病情程度越重，TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ表達(dá)越低。由此推測(cè)，其盆腔器官脫垂的程度越重，其盆底支持組織所受的牽拉力度越大，由于機(jī)械應(yīng)力的增加可降低TGF-β1的表達(dá)[18-19]，其損傷修復(fù)因子TGF-β1表達(dá)越少，其代償性修復(fù)的能力越弱，TIMP-1表達(dá)及Collagen Ⅲ的含量就越少。

綜上所述，TGF-β1、TIMP-1及Collagen Ⅲ可能通過調(diào)節(jié)膠原代謝及膠原含量，從而導(dǎo)致盆底支持組織強(qiáng)度及韌性的改變，參與POP的發(fā)生、發(fā)展。且三者之間存在一定的協(xié)同作用，共同參與POP的發(fā)生發(fā)展。本研究為今后進(jìn)一步探索POP的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，為POP預(yù)防及治療等方面提供新的思路及方向。