利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導恒溫擴增技術建立新型冠狀病毒核酸快速檢測方法

李 歡，徐秋月，王云娟，蘇 洋，唐睿珠

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，云南省實驗診斷研究所，云南省檢驗醫(yī)學重點實驗室，云南 昆明 650032）

2019 年 12月，我國武漢市報道了多例病原體不明的肺炎病例，隨后在全中國乃至世界多國暴發(fā)流行。2020 年 1 月 7 日，ZHOU 等[1]通過病毒分離和基因組測序，發(fā)現(xiàn)引起該肺炎的是一種新型冠狀病毒。國際病毒分類委員會將其正式命名為嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[2]。SARS-CoV-2屬于β冠狀病毒屬，其基因組為單鏈正股RNA，長度為29 881個核苷酸[3]。SARS-CoV-2感染導致的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）傳染性強，人群普遍易感，目前全球的疫苗普及率還有待提高，因此及早發(fā)現(xiàn) SARS-CoV-2 感染者并進行有效的隔離與治療，仍是當下控制疫情最有效的方法。核酸檢測是確診 SARS-CoV-2 感染的最主要的依據(jù)，血清學抗體檢測是重要的補充方法。目前可用于 RNA 病毒的核酸檢測技術主要有基因測序、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片和恒溫核酸擴增等。其中Real-Time qRT-PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR）檢測方法是首選方案[4]，但該法對操作人員、設備以及實驗室環(huán)境等要求較高?；驕y序和基因芯片技術需要特殊設備，如測序儀、電泳儀及凝膠記錄系統(tǒng)等，且存在檢測周期長、操作復雜等諸多不便因素。這些方法并不適用于現(xiàn)場、基層醫(yī)療單位及資源貧乏的環(huán)境下使用。云南省位于我國邊境，防疫情輸入壓力巨大，邊境地區(qū)條件有限，因此疫情防控工作中需要采用高性能、快速且易操作的方法來進行新冠病毒核酸檢測。

恒溫擴增技術是新發(fā)展起來的一種核酸檢測技術，由于其擴增不需要變溫循環(huán)的特點受到關注，有望成為分子診斷中PCR的替代技術[5-6]。不同于常規(guī)PCR方法，恒溫擴增方法不需要變溫儀器和多個熱循環(huán)程序，只需要在一個恒定的溫度下就可對核酸進行指數(shù)擴增。其中逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導恒溫擴增（RT-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是在恒溫條件下，利用鏈置換DNA聚合酶和針對靶基因6～8個區(qū)域設計的4～6條引物即可實現(xiàn)對RNA進行快速（擴增時間通常小于1 h）高效（大于109倍）擴增的檢測技術。并且反應結束之后，不需要儀器，憑借肉眼觀察顏色變化即可知道擴增結果為陰性或陽性。環(huán)介導恒溫擴增技術在儀器需求、檢測效率、操作方法、結果判讀等方面均具有優(yōu)勢，非常適合在條件有限的環(huán)境下使用。

1 材料與方法

1.1 新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質(zhì)

筆者從中國計量科學研究院訂購了編號為GBW（E）091099的新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質(zhì)。該標準物質(zhì)為人源核糖核酸基因組，含有新型冠狀病毒全部基因，包括全長的特征核殼蛋白N基因和開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因。N基因濃度為1.73×103copies/μL，ORF1ab基因濃度為8.96×102copies/μL。

1.2 核酸提取

新冠病毒標準物質(zhì)用DNA/RNA磁珠法核酸提取試劑盒（天隆科技有限公司，西安，中國）提取，按廠家說明書進行操作。提取好的核酸放置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計

為了鑒定SARS-CoV-2，選擇其特異性的ORF1ab基因和N基因作為目標基因，從GeneBank下載這兩個目標基因的序列。參照疾病預防控制中心（CDC）公布的特征核殼蛋白N基因和開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因檢測靶位[7]附近，采用Geneious10.2.3軟件將各序列段與SARS病毒、MERS病毒和甲乙流感病毒序列進行比對，以確保所選序列的特異性，并用primer explorer V.5（http://primerexplorer.jp/e/）軟件設計各靶基因的LAMP反應引物：F3，B3兩條外引物和FIP，BIP兩條內(nèi)引物以及LF或LB環(huán)引物，各亞型引物序列見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 RT-LAMP引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-LAMP

1.4 RT-LAMP反應

LAMP檢測試劑為WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master 1.4 mM的dNTP Mix，320 U的Bst3.0 DNA Polymerase），2.5 μL 引物混合液（FIP、BIP各40 pmol，B3和F3為5 pmol，LB為20 pmol），1 μL cDNA模板，9 μL Rnase free水。RT-LAMP擴增條件為65 ℃、60 min，擴增儀器使用基因擴增儀（天隆Genesy 96T，西安，中國）。當試劑反應體系由紅色變?yōu)辄S色時結果判斷為陽性，若始終為紅色則為陰性。

1.5 特異性評價

將新型冠狀病毒標準物質(zhì)用于特異性評價，先提取標準物質(zhì)的RNA，再用針對ORF1ab基因和N基因兩套引物分別進行RT-LAMP檢測，以甲型、乙型流感病毒質(zhì)粒以及滅菌注射用水為模板作陰性對照。以新型冠狀病毒標準物質(zhì)為模板時，結果應為陽性；以甲乙流感病毒質(zhì)粒以及去離子水為模板時，結果應為陰性。

1.6 最低檢測限評價

將提取出的新型冠狀病毒標準物質(zhì)（N基因濃度 為1.73×103copies/μL，ORF1ab基因濃度為8.96×102copies/μL）用 DEPC水（diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）稀釋至0.50×103copies/μL（目前臨床常用的商品化qRT-PCR試劑的最低檢測限）附近。N基因濃度稀釋為0.87×103copies/μL、0.50×103copies/μL、0.40×103copies/μL。ORF1ab基因濃度稀釋為0.60×103、0.50×103copies/μL。準備10份原濃度和各稀釋濃度的標準物質(zhì)后分別提取核酸，再采用RT-LAMP方法進行檢測，以陽性檢出率為100%的最低濃度為該目標基因的最低檢測限濃度。

1.7 抗干擾能力評價

以一例正常人新鮮血液樣本、一例鼻腔分泌物、滅菌注射用水和細胞保存液樣本分別作為干擾物，各吸取20 uL（按提取樣本體積的10%）加入到稀釋至最低檢測限的新型冠狀病毒標準物質(zhì)和滅菌注射用水中參與提取，然后用RT-LAMP方法進行檢測。加入干擾物后，檢測結果的陰陽性應不受影響。

1.8 最佳反應時間評價

觀察以稀釋至各基因最低檢測限的新型冠狀病毒標準物質(zhì)為模板在不同的RT-LAMP擴增時間（40 min，50 min，60 min）的反應結果，以權衡選擇最佳的反應時間。

2 結果

2.1 特異性評價

設計針對新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因出的2套內(nèi)、外引物，并在其中篩選出的一套最佳引物和相應的環(huán)引物。以新型冠狀病毒標準物質(zhì)為模板時，RT-LAMP反應結果應為陽性；以甲型、乙型流感病毒質(zhì)粒和滅菌注射用水為模板時，RT-LAMP反應結果為陰性（圖1）。

圖1 特異性評價Fig.1 Evaluation of specificity

2.2 最低檢測限評價

采用RT-LAMP方法將10份原濃度和各稀釋濃度的新型冠狀病毒標準物質(zhì)進行檢測，以100%陽性檢出率的最低濃度為該目標基因最低檢測限。因此ORF1ab基因的最低檢測限為0.60×103copies/μL（圖2），N基因的最低檢測限為0.50×103copies/μL（圖3）。

圖2 ORF1ab基因的最低檢測限評價Fig.2 Evaluation of limit of detection of ORF1ab gene set

圖3 N基因的最低檢測限評價Fig.3 Evaluation of limit of detection of N gene set

2.3 抗干擾能力的評價

針對新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因2套試劑體系在新型冠狀病毒標準物質(zhì)（模擬陽性樣本）和滅菌注射用水（模擬陰性樣本）中的抗血液、鼻分泌物和樣本保存液干擾能力良好，陰陽符合率均為100%（圖4）。

圖4 抗干擾能力評價Fig.4 Evaluation of anti-interference ability

2.4 最佳反應時間評價

為了評估新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因RT-LAMP的最短擴增時間，將標準物質(zhì)稀釋至最低檢測限附近進行RT-LAMP反應，在40 min，50 min，60 min時結束反應。結果表明ORF1ab基因在50 min變?yōu)殛栃?，N基因在40 min變?yōu)殛栃裕▓D5）。并且N基因在40 min仍然為陽性。因此，50 min為該體系的最佳反應時間。

2.5 結果的判讀

在SARS-CoV-2的結構蛋白中，N蛋白是最保守的，檢測序列特異性的N基因可作為冠狀病毒屬初步篩選的靶位。ORF1ab基因的同源性較低，可作為區(qū)分SARS-CoV-2與其他冠狀病毒的重要靶位。因此，聯(lián)合N基因和ORF1ab基因的檢測結果進行綜合分析，可盡量避免樣本漏檢和假陽性。因為本試劑體系是對兩個基因分別進行檢測，所以其實驗結果應綜合分析，對于結果的判讀見表2。

表2 RT-LAMP反應結果的判讀Tab.2 Strategies for judging RT-LAMP results of SARS-COV-2

3 討論

雖然目前我國已經(jīng)有效控制住了新型冠狀病毒的傳播，進入疫情防控常態(tài)化階段，但境外新冠肺炎疫情仍然呈暴發(fā)蔓延態(tài)勢。云南省位于我國邊境與多個國家接壤，并且近期鄰國緬甸國內(nèi)爆發(fā)政變，導致邊境城市疫情輸入和擴散風險劇增。根據(jù)目前最新版新冠肺炎診療方案，確診新型冠狀病毒肺炎的首要標準仍為新冠病毒核酸陽性，而新冠病毒特異性抗體僅作新型冠狀病毒核酸檢測的補充指標，不能完全作為新冠肺炎的確診依據(jù)。qRT -PCR 法是目前檢測新冠病毒核酸最常用方法，但對操作人員、設備以及實驗室環(huán)境等要求較高[8]，對于實驗條件有限的邊境地區(qū)不太適用，因此在邊境疫情防控工作中需要采用高靈敏、易操作、檢測周期短的方法來進行新型冠狀病毒肺炎核酸檢測。

核酸擴增技術分為2大類：一類是以PCR為代表的非恒溫擴增技術，另一類則是恒溫擴增技術。近年來核酸恒溫擴增技術得到了迅猛的發(fā)展與完善。其中，環(huán)介導恒溫擴增技術只需在某個恒定的溫度下、一個反應步驟即可擴增特異性核酸片段。該技術不需要精密的儀器對反應體系進行反復升降溫，同時省去了多個循環(huán)進行變性、退火和延伸的耗時過程。并且LAMP技術的一個明顯優(yōu)勢是可進行高通量檢測，可實現(xiàn)標本的連續(xù)檢測。由于該技術對引物設計要求很高，針對靶基因上6個區(qū)域設計特異性的引物，因此大幅提高了擴增反應的特異性。并且對于反應結果的判讀簡潔明了，只需要肉眼觀察有無擴增反應產(chǎn)物生成就可以確認是否有靶基因存在。LAMP技術簡單、快速、特異性強，去除了精密復雜的儀器設備的限制，反應時間短，結果判讀簡潔直觀[9-10]。因為反應溫度恒定，在檢測過程中可不斷插入新樣本而對之前的反應不會造成影響，因此可實現(xiàn)標本高通量的自動化檢測，十分適合在邊境地區(qū)推廣和應用。常用的LAMP 擴增結果的目測方法有濁度指示法、熒光染料法以及指示劑顯色法等。濁度指示法是在試劑體系中加入鈣黃綠素，在反應結束后就可通過擴增產(chǎn)物的渾濁度來判讀陰陽性。熒光染料法通常以 SYBR Green I作為顯色指示劑，但該熒光染料需要反應后開蓋加入，增加了擴增產(chǎn)物污染實驗室的風險。我們選用的是 NEB 公司產(chǎn)品，反應前已經(jīng)預加入酚紅為顯色指示劑，酚紅顏色在擴增反應前后隨產(chǎn)物pH 值變化而變化（如在 pH 值高于8.2時為紅色，而低于6.6時為黃色），肉眼判讀結果比較直觀[11-12]。

引物組屬于檢測體系的核心組分，我們選擇新冠病毒的ORF1ab基因和N基因作為目標檢測基因。針對新冠病毒核酸的檢測，ORF1ab基因特異度高，N基因敏感度高，單獨使用ORF1ab基因和N基因的準確率分別為99%、92.3%，聯(lián)合檢測結果的準確率為99%[13]。通過對兩個基因的聯(lián)合檢測，N基因可以檢測到低載量的病毒，降低漏檢率，ORF1ab基因可以降低假陽性率，因而既保證了SARS-CoV-2檢測的敏感性也保證了特異性。筆者參照CDC公布的新冠病毒的ORF1ab和N基因檢測靶位附近分別設計出針對兩個基因的3套內(nèi)、外引物。從這些引物中測試、篩選出最佳的引物組。進而設計了這些最佳引物的環(huán)引物，以縮短反應時間，繼續(xù)篩選出最佳的環(huán)引物后，系統(tǒng)優(yōu)化、獲取了RT-LAMP檢測體系。并在特異性、最低檢測限、抗干擾能力和最佳反應時間實驗中，經(jīng)檢測標準物質(zhì)，結果與預期相符，證實了該檢測體系的可行性。

本研究所建立的新冠病毒RT-LAMP的方法依然存在一些局限性，例如檢測結果雖然可以通過顏色變化來斷定，但這種判斷具有一定主觀性，而且肉眼觀察的顏色變化的敏感性相對較差[14]，如采用熒光方法進行檢測將明顯提升檢測的敏感性，同時采用儀器進行檢測可避免肉眼判斷結果的主觀性，但是我們的體系是針對的是條件有限的邊境地區(qū)，因此用肉眼觀察適用性更強。此外，本研究建立的方法的靈敏度還不夠理想。提高靈敏度可考慮擴大反應體系，增加提取核酸的量、增大模板量等，但是這將增大試劑成本。

總之，筆者建立的新冠病毒RT-LAMP方法已達到了研究目的，基于此方法的高特異性，高靈敏度，低成本的特性，非常適合在條件有限的邊境地區(qū)開展利用。