M2e-HA2串聯(lián)表位的自組裝納米顆粒流感疫苗的構(gòu)建及血清學(xué)檢測

范琪琪，李 恒，趙 鑫，周 健，郭 磊，秦 麗，劉龍丁

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118）

流感病毒因其高發(fā)的點突變率和基因重排使疫苗和抗病毒藥物很容易失去作用[1-2]，一旦遇到高耐藥性、突變位點特殊的流行株很難實現(xiàn)及時高效的人為干預(yù)，可能導(dǎo)致流感大流行，給人類健康和社會穩(wěn)定帶來極大挑戰(zhàn)。季節(jié)性流感在全球范圍內(nèi)每年可引起1 000 000 000人發(fā)病，650 000人死亡[3]。上個世紀(jì)以來曾發(fā)生至少 4次流感大流行，即1918年西班牙H1N1流感、1957年亞洲 H2N2流感、1968年香港H3N2流感和2009年H1N1豬流感[4]。近幾年H7N9禽流感[5]和H5N1豬流感[4]流感病毒感染人類的爆發(fā)已經(jīng)形成了公共衛(wèi)生和社會經(jīng)濟的負(fù)擔(dān)，并且提示了建立積極應(yīng)對預(yù)防的緊迫性和必要性。加強建立快速的疫情控制手段，最有效最直接的方式就是快速研制針對不同亞型均具有保護性的廣譜性疫苗。

鑒于傳統(tǒng)裂解疫苗在流感病毒流行和爆發(fā)期間的預(yù)防在時效性和保護性方面并不非常理想，因此能夠交叉中和不同型流感病毒的新型流感疫苗或通用型流感疫苗是當(dāng)前疫苗發(fā)展的一個熱點。新型流感疫苗設(shè)計的發(fā)展趨勢包括選擇更加保守的靶抗原、加快候選疫苗株的高效篩選及充分提高疫苗的保護效果。在甲型流感疫苗領(lǐng)域，高度保守的抗原結(jié)構(gòu)域以及位于病毒囊膜表面的抗原特性決定了HA莖部[6-9]和M2e[10-11]可以作為廣譜流感疫苗的主要靶點，也成為目前流感病毒通用疫苗研究的熱點。

為了更為有效地展示這類亞單位抗原，將候選抗原與能發(fā)生自組裝的蛋白分子嵌合表達，形成納米蛋白顆粒。幽門螺桿菌轉(zhuǎn)鐵蛋白（Ferritin）是近年來開發(fā)運用于制備納米顆粒疫苗的首選載體之一[12-14]。鐵蛋白由24個鐵蛋白亞基自組裝而成，其中每3個亞基組成一個三聚體亞單位，8個三聚體再組裝成一個外徑12 nm，內(nèi)徑8 nm的球形空心納米籠狀結(jié)構(gòu)[15]。2013年，Kanekiyo等[12]通過將H1亞型HA與幽門螺桿菌鐵蛋白亞基N端融合表達，重組蛋白自發(fā)裝配形成多聚體球狀納米顆粒結(jié)構(gòu)[16-21]，HA抗原表達展示于球狀納米粒的表面，產(chǎn)生了良好的免疫應(yīng)答。

本項目基于流感病毒血凝素HA蛋白的莖部基因和基質(zhì)蛋白基因的保守性，將研究幽門螺桿菌轉(zhuǎn)鐵蛋白Ferritin與A型流感病毒HA2、M2e串聯(lián)表達在真核表達系統(tǒng)中，生成可以展示HA2和M2e抗原的自組裝抗原顆粒，從蛋白結(jié)構(gòu)、免疫抗原性等方面進行評估，為進行流感病毒新型疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用M2e基因來自于本實驗室前期合成，HA與ferritin串聯(lián)的基因序列由華大基因公司全基因合成。高保真Taq酶、In-fusion試劑、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ購自于TAKARA，轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent購自于Promega，His、M2抗體購自于Abcam。

1.2 M2e-HA2自組裝納米顆粒載體構(gòu)建

使用高保真Taq酶分別擴增得到M2e序列和HA2與Ferritin串聯(lián)的基因序列，并在M2e的5′端和HA2-ferritin的3′端分別加上Hind Ⅲ和Xho I限制性內(nèi)切酶位點。使用In-fusion將M2e、HA2-ferritin以及經(jīng)上述兩種限制性內(nèi)切酶線性化的pcDNATM3.1質(zhì)粒連接到一起。將陽性單克隆菌落提取質(zhì)粒后進行測序和酶切驗證。

1.3 M2e-HA2自組裝納米顆粒表達驗證

使用FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑將pcDNATM3.1-M2e-HA2-ferritin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并進行非變性條件蛋白提取。細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融3次后，經(jīng)6 s ON，3 s OFF超聲破碎10 min，12 000 r/min離心30 min后收集上清，獲得M2e-HA2-ferritin納米自組裝顆粒蛋白。使用his和M2抗體進行非變性條件和變性條件下的Western blot驗證。

1.4 M2e-HA2自組裝納米顆粒純化及驗證

使用Ni-NTA填料進行M2e-HA2-ferritin親和層析純化，進行梯度洗脫并收集200 mM咪唑和300 mM咪唑洗脫液洗脫樣品，使用10 kD超濾管進行蛋白富集。使用2 mM PBS緩沖液將蛋白樣品經(jīng)2 mm透析袋透析過夜，BCA法測定蛋白濃度。使用his和M2抗體進行非變性條件和變性條件下的Western blot驗證，并使用透射電鏡觀察蛋白樣品。

1.5 M2e-HA2自組裝納米顆粒免疫血清學(xué)驗證

每只Balb/c小鼠皮下注射免疫10 μg M2e-HA2納米自組裝顆粒，間隔2周后進行第2次加強免疫。采集小鼠血清，1∶200稀釋血清作為一抗進行Western blot檢測納米顆粒的抗原性。使用人工合成的M2e和HA2的多肽進行ELISA檢測，分析針對M2e和HA2特異性抗體水平。其中，M2e多肽序列為SLLTEVETPIRN，HA2多肽序列為MIDGWYGYHHQN。

2 結(jié)果

2.1 M2e-HA2自組裝納米顆粒載體構(gòu)建

PCR獲得M2e序列大小139 bp，HA2-ferritin序列大小1 210 bp。陽性單克隆菌落提取質(zhì)粒測序驗證沒有發(fā)生堿基突變，并且使用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ酶切驗證得到1 296 bp的陽性片段。DNA Marker為DL2000（TAKARA），見圖1。

圖1 M2e-HA2自組裝納米顆粒載體構(gòu)建Fig.1 Construction of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles

2.2 M2e-HA2自組裝納米顆粒表達驗證

將M2e-HA2-ferritin載體轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，48 h后收樣進行非變性和變性條件下的Western blot檢測。非變性Western blot得到特異產(chǎn)物帶在180 kD以上，證明M2e-HA2-ferritin在細(xì)胞內(nèi)形成多聚體高級結(jié)構(gòu)。變性Western blot產(chǎn)物即為M2e-HA2-ferritin單體，大小在48.355 kD，見圖2。

圖2 M2e-HA2自組裝納米顆粒表達驗證Fig.2 Validation of expression of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles

2.3 M2e-HA2自組裝納米顆粒純化及驗證

將非變性提取蛋白使用Ni-NTA親和層析純化并進行過夜透析后，進行非變性和變性條件下的Western blot檢測。非變性考馬斯亮藍染色和Western blot得到特異產(chǎn)物帶在180 kD以上，變性Western blot產(chǎn)物大小在48.355 kD。透射電鏡觀察M2e-HA2純化產(chǎn)物可以看到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定大小在100 nm左右的納米顆粒。測定蛋白濃度為204 ng/μL，見圖3。

圖3 M2e-HA2自組裝納米顆粒純化產(chǎn)物驗證Fig.3 Validation of purified products of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles

2.4 M2e-HA2自組裝納米顆粒免疫血清學(xué)驗證

使用免疫小鼠血清在變性和非變性條件下檢測M2e-HA2納米自組裝顆?？乖?，使用M2e-HA2二免小鼠血清1∶200稀釋作為一抗，變性條件下得到48.355 kD的陽性帶，非變性條件下得到180 kD以上的特異帶。ELISA檢測M2e-HA2二免小鼠血清中特異性抗體水平，針對M2e的抗體水平達到1∶1 066.667，針對HA2的抗體水平達到1∶1 333.333，見圖4。

圖4 M2e-HA2自組裝納米顆粒免疫血清學(xué)驗證Fig.4 Immune serological validation of M2e-HA2 self-assembled nanoparticles

3 討論

新型流感疫苗設(shè)計的發(fā)展趨勢包括選擇更加保守的靶抗原、加快候選疫苗株的高效篩選及充分提高疫苗的保護效果。與重配技術(shù)或VLPs流感疫苗研究相比，保守抗原的自組裝顆粒最顯著地區(qū)別在于流感病毒主要血清抗原保守區(qū)域與特定生物分子嵌合表達后，能夠在真核表達系統(tǒng)中自行組裝成納米球體。在甲型流感疫苗領(lǐng)域，高度保守的抗原結(jié)構(gòu)域以及位于病毒囊膜表面的抗原特性決定了HA2和M2e作為廣譜流感疫苗的主要靶點。本項目通過M2e-HA2抗原的新型流感疫苗抗原自組裝技術(shù)制備平臺，為迅速有效的研發(fā)和生產(chǎn)具有時效性的流感通用疫苗提供具體的技術(shù)參考、技術(shù)儲備和產(chǎn)品后備。

常規(guī)流感疫苗的研發(fā)主要有以下幾種策略：（1）由WHO及各國CDC監(jiān)測年度流行株，提交至WHO分析后給出推薦疫苗株，由各個國家生產(chǎn)疫苗；（2）通過從確診為甲流病毒感染病人的樣本中分離獲得病毒，接種至雞胚培養(yǎng)病毒，通過大量雞胚培養(yǎng)獲得用于疫苗生產(chǎn)；（3）通過特定細(xì)胞株的適應(yīng)培養(yǎng)，使流行株在細(xì)胞培養(yǎng)傳代后成為減毒株，擴增后制備成疫苗；（4）通過反向遺傳技術(shù)獲得人工重配的特定重組病毒，并經(jīng)細(xì)胞適應(yīng)后篩選株制備的疫苗。流感疫苗HA-M2e抗原顆粒技術(shù)與重配技術(shù)或VLPs流感疫苗研究相比，自組裝顆粒最顯著地區(qū)別在于流感病毒主要血清抗原保守區(qū)域與特定生物分子嵌合表達后，能夠在真核表達系統(tǒng)中自行組裝成納米球體，并在球體表面展示HA2和M2e抗原，嵌合表達納米蛋白顆粒具有較強烈的免疫刺激作用，能有效激活體液免疫，產(chǎn)生高效價的抗體。

本項目基于流感病毒血凝素HA蛋白的莖部基因和基質(zhì)蛋白基因的保守性，構(gòu)建可以展示M2e和HA2抗原的自組裝抗原顆粒，從蛋白結(jié)構(gòu)、免疫抗原性等方面進行評估，證明M2e-HA2串聯(lián)的自組裝納米顆?？梢源碳ば∈螽a(chǎn)生高水平的M2e和HA2特異性抗體，為通用流感疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。