1 800 MHz射頻電磁場暴露對大鼠海馬GFAP、NCAM和GABA受體表達的影響

張盛慶宇 ，舒 逍 ，吳錫南 ，李志強 ，武慧欣 ，張 媛 ，蔣玉融 ，楊思佳 ，木云珍

（1）昆明醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院；2）研究生院；3）生物醫(yī)學工程研究中心；4）基礎醫(yī)學院，云南 昆明 650500）

射頻電磁場（radiofrequency electromagnetic field，RF）是指頻率在100 kHz～300 GHz的電磁場，主要由手機、基站等通訊設備產(chǎn)生[1]。相關研究報道，長期的射頻電磁場暴露可能對生物體的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面均有不同程度的影響[2]。機體大腦是對射頻電磁場敏感的器官之一[3]，腦組織受到射頻電磁場后，會出現(xiàn)學習和記憶功能的改變，這是射頻電磁場生物學效應的重點研究領域之一。膠原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質(zhì)細胞中特異性的中間絲蛋白，隨著生長發(fā)育過程發(fā)生變化，并在神經(jīng)退行性病變過程中發(fā)生相應改變[4]。神經(jīng)細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）是成人神經(jīng)可塑性的主要貢獻者，可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復、神經(jīng)發(fā)育以及與年齡相關的認知功能下降等過程[5-6]。γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，許多研究都已經(jīng)證實GABA與認知、學習記憶密切相關[7-8]。本研究通過觀察SD大鼠暴露后的體重及其海馬內(nèi)的GFAP、NCAM和GABA受體的變化，評估射頻電磁場對大鼠的生理發(fā)育指標和海馬體的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組

14只7周齡SPF級SD大鼠，雄鼠體重均在250～270 g，雌鼠體重均在200～220 g，由上海斯萊克實驗動物公司提供［動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005］。適應環(huán)境1周后，分為暴露組和對照組，每組7只。暴露組雌雄比例3∶4，對照組雌雄比例4∶3。每天暴露時間固定12 h（20:00～8:00），持續(xù)3周。

1.2 暴露裝置

射頻電磁場暴露裝置如之前研究所描述[9]，由惠普公司生產(chǎn)的信號發(fā)生裝置（8614A Signal Generator 0.8～2.4 GHz）連接1個放大器（SCD Amplificateur Lineaire 1.3～2.6 GHz Made France）產(chǎn)生頻率1 800 MHz微波，功率密度為0.5 mW/cm2。

1.3 主要儀器與試劑

兔抗鼠GFAP多克隆抗體（武漢博士德公司），山羊抗兔SP免疫組化試劑盒和DAB染色劑（福州邁新公司），多聚甲醛、明膠等免疫組化實驗常規(guī)試劑均為分析純，8592C頻譜分析儀（惠普，美國），Model7620微波輻射測試儀（Narda，美國），8614A信號發(fā)生裝置、信號放大器（惠普，美國），TX-B8H WiFi 2 400 MHz 發(fā)射裝置（深圳市特信電子有限公司，中國），CM1900冰凍切片機（德國萊卡公司），90i攝影生物顯微鏡（日本尼康公司），Image Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)（美國 Media Cybernetics 公司）。

1.4 大鼠海馬組織CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)GFAP表達的測定

1.4.1 取材大鼠用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，解剖后經(jīng)主動脈插管，用4%多聚甲醇溶液（pH=7.4）灌流固定，斷頭取腦，浸入裝有多聚甲醇溶液的容器中，放在4 ℃冰箱中后固定

1.4.2 組織切片將固定好的腦組織塊應用梯度蔗糖溶液脫水至腦組織沉底，隨后將大鼠海馬組織從腦組織中分離，再用冰凍切片機將海馬組織沿長軸方向行20 μm厚的連續(xù)冠狀切片，每個海馬組織取20～30張切片，將切片放入0.01 ml/L磷酸鹽緩沖液中孵育保存并盡快測定。

1.4.3 免疫組化染色使用免疫組化反應鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法（streptavidin-peroxidase method，SP法）進行染色，按說明書操作。用PBS沖洗，加一抗（1∶4 000）4 ℃過夜。再次用PBS沖洗，二抗37 ℃ 2 h。常規(guī)脫水，透明，封片。

1.4.4 圖像及分折每張切片分別在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)隨機選取2個視野攝片，每張切片拍攝6次。拍片時均使用研究級顯微鏡，預實驗找到最佳拍攝條件后，所有標本均按此條件進行拍片。拍攝完成后用IPP6.0圖像分析軟件進行圖片分析，測定GFAP、NCAM、GABA陽性染色平均光密度值（mean optical density，MOD），然后求6個視野所測MOD值的平均值，此平均值即為該區(qū)域的最終MOD值。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0錄入數(shù)據(jù)進行分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗進行比較，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，P＜ 0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般結果

各組未發(fā)現(xiàn)老鼠出現(xiàn)死亡和其他異常情況，外觀正常。各組體重指標經(jīng)統(tǒng)計分析，差異無統(tǒng)計學意義（p＞ 0.05），2組大鼠的體重無明顯不同，見表1。

表1 大鼠一般情況分析（）Tab.1 General situation analysis of rat（）

表1 大鼠一般情況分析（）Tab.1 General situation analysis of rat（）

2.2 GFAP在大鼠海馬各區(qū)的表達

GAFP在大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)均有表達，陽性免疫組化染色結果呈褐色或棕褐色，形似蜘蛛，見圖1。

圖1 GFAP在大鼠海馬各區(qū)的表達（SP法染色，×400）Fig.1 Expression of GFAP in rat hippocampus（SP，×400）

2.2.1 GFAP在大鼠海馬各區(qū)MOD結果比較海馬各區(qū)GFAP經(jīng)統(tǒng)計分析，與對照組相比，CA1區(qū)、DG區(qū)差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），CA3區(qū)無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。經(jīng)射頻電磁輻射21 d，暴露組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)GFAP的表達下降，見表2。

表2 大鼠海馬不同區(qū)域的GFAP表達MOD值（）Tab.2 MOD value of GFAP expression in different regions of rat hippocampus（）

表2 大鼠海馬不同區(qū)域的GFAP表達MOD值（）Tab.2 MOD value of GFAP expression in different regions of rat hippocampus（）

與對照組相比，*P ＜ 0.05。

2.3 NCAM在大鼠海馬各區(qū)的表達

NCAM受體在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)均有表達，陽性表達免疫組化呈棕色或棕褐色，形狀為顆粒狀，見圖2。

2.3.1 NCAM免疫組織MOD結果比較NCAM表達的海馬各區(qū)MOD值經(jīng)統(tǒng)計分析分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。經(jīng)射頻電磁輻射21 d，暴露組大鼠海馬各區(qū)NCAM的表達無改變，見表3。

表3 大鼠海馬不同區(qū)域的NCAM表達MOD值（）Tab.3 MOD value of NCAM expression in different regions of rat hippocampus（）

表3 大鼠海馬不同區(qū)域的NCAM表達MOD值（）Tab.3 MOD value of NCAM expression in different regions of rat hippocampus（）

2.4 GABA在海馬各區(qū)的表達

GABA 受體在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)均有表達，陽性表達免疫組化呈棕色或棕褐色，形狀為顆粒狀，見圖3。

圖3 GABA在大鼠海馬各區(qū)表達（免疫組化SP法染色，×400）Fig.3 The expression of GABA in rat hippocampus（SP，×400）

2.4.1 GABA免疫組織MOD值比較結果GABA表達的海馬各區(qū)MOD值經(jīng)統(tǒng)計分析結果如下，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。經(jīng)射頻電磁輻射21 d，暴露組大鼠海馬各區(qū)NCAM的表達無改變，見表4。

表4 大鼠海馬不同區(qū)域的GABA表達MOD值（）Tab.4 MOD value of GABA expression in different regions of rat hippocampus（）

表4 大鼠海馬不同區(qū)域的GABA表達MOD值（）Tab.4 MOD value of GABA expression in different regions of rat hippocampus（）

3 討論

本次實驗選擇的GFAP、NCAM、GABA受體變化可反應RF-EMF對腦部的損傷程度暴露條件，模擬人群所處的1 800 MHz射頻電磁場環(huán)境，進行全身暴露。經(jīng)過3周，12 h/d的暴露后，2組大鼠的形態(tài)學未發(fā)現(xiàn)改變，大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)GFAP的表達下降。

海馬體是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是學習記憶功能的結構基礎[10-14]。Maskey等[15]將大鼠暴露于835 MHz射頻電磁場中，暴露1個月后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)變性。在Altum等[16]的報告中，在射頻電磁場暴露15 d，海馬CA1區(qū)和CA2區(qū)神經(jīng)元明顯減少，而CA3區(qū)無明顯差異。有報道，每天通過手機產(chǎn)生的900 MHz射頻電磁場，動物暴露此環(huán)境15 d后，在海馬CA1、CA3和齒狀回亞區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)變性[17]。由此，筆者推測射頻電磁場可能海馬的CA1、CA3和DG區(qū)有所影響。

星形膠質(zhì)細胞能夠調(diào)節(jié)腦內(nèi)的離子和神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，具有代謝功能，并在腦損傷時做出反應[18]。GFAP與阿爾茨海默?。╝lzheimer’s disease，AD）、抑郁癥、中風和腦缺血等腦部疾病有關[19-21]。相關研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠暴露于高強度射頻電磁場后發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)GFAP含量增加并對記憶功能有所影響[22]。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，將50只雄性大鼠暴露在高功率的射頻電磁場后發(fā)現(xiàn)，大鼠的學習記憶明顯降低，星形膠質(zhì)細胞中的GFAP含量增加[23]。因此，GFAP含量的增多可能會導致學習和記憶功能下降。NCAM與膠質(zhì)細胞瘤、一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病和癡呆等疾病有關[24-26]，同時也參與了學習記憶的過程。研究發(fā)現(xiàn)，1 800 MHz電磁波，度值為0.5 m W/cm2的暴露下可致出生后SD大鼠海馬NCAM表達下調(diào)，并且NCAM的下調(diào)可能是低劑量電磁波影響學習記憶的原因之一[27-28]。γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，具有極重要的功能，與認知功能存在一定的關系。早期便有研究者證明了在一定條件的電磁輻射暴露下，GABA受體表達較對照組增高進而可能影響人的神經(jīng)行為[29]。另外，在強度為2 450 MHz，功率密度為為5.0、10.0 mW/cm2的條件下，研究者發(fā)現(xiàn)昆明小鼠的GABA含量增高，學習記憶損傷逐漸加重[30]。在其他領域也證實，低功率密度微波輻射可以通過增加GABA、降低谷氨酸對小鼠的學習記憶產(chǎn)生損害[31]。

本研究結果表明，大鼠暴露于射頻電磁場21 d后，大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)GFAP的表達下降。根據(jù)相關的研究，筆者認為，在本實驗條件下，1 800 MHz射頻電磁場暴露可對海馬CA1和DG區(qū)的GFAP表達有影響，本實驗只進行了初步探索，在同樣條件是否對海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)以及DG區(qū)的GFAP、NCAM和GABA受體表達產(chǎn)生影響，還需要進一步的研究。