植物源性食品中手性農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究進展

陳丹丹，萬建春，郭 平，張 威，喻俊磊，吳 遙，王 棟*

(1.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；3.南昌海關 技術(shù)中心，江西 南昌 330038)

手性農(nóng)藥是指含一個或多個手性中心的農(nóng)藥，只有約7%的手性農(nóng)藥以純對映異構(gòu)體或富含一種對映異構(gòu)體的混合物的形式銷售[1]。大部分手性農(nóng)藥都是以外消旋體的形式進行生產(chǎn)、銷售和使用[2]。我國的農(nóng)藥市場中手性農(nóng)藥大概占40%[3]，可見手性農(nóng)藥的市場占比份額較大，手性農(nóng)藥通常由不同活性的對映體組成，對映體的分子式是相同的，其理化性質(zhì)幾乎都是一樣的，在非手性環(huán)境下沒有什么不同，但是在不同的手性環(huán)境下卻表現(xiàn)出不同的生物活性、選擇性、毒性等[4]。Zhang等[5]研究表明S-氟雷拉納(S-Fluralaner)抗二化螟與灰飛虱的活性比R-氟雷拉納(R-Fluralaner)高33～39倍。齊艷麗等[6]研究表明睛菌唑在番茄中降解表現(xiàn)為S-(+)-腈菌唑比R-(-)-腈菌唑先降解。潘興魯[7]研究表明啶菌噁唑?qū)Υ笮蜏卸拘缘亩拘员憩F(xiàn)為：(-)-RS-啶菌噁唑>(-)-RR-啶菌噁唑>Rac-啶菌噁唑>(+)-SR-啶菌噁唑>(+)-SS-啶菌噁唑；苯酰菌胺對映體對羊角月牙藻與大型溞的毒性表現(xiàn)為(-)-R-苯酰菌胺>Rac-苯酰菌胺>(+)-S-苯酰菌胺。陳增龍[4]研究表明在中性的砂質(zhì)土壤中，R-(-)-呋蟲胺優(yōu)先降解導致S-(+)-呋蟲胺相對富集，而在酸性與堿性的粉質(zhì)土壤中降解選擇性則相反，S-(+)-呋蟲胺則優(yōu)先降解。相關研究報道表明：不是所有手性農(nóng)藥的對映體都有生物活性，有的活性低，甚至還有毒性，對非靶標生物造成危害，因此加強對手性農(nóng)藥的分離，以獲得有生物活性的單一的手性農(nóng)藥對映體對綠色農(nóng)藥的發(fā)展存在益處，既能對靶標生物發(fā)揮較好的生物活性，又不會對非靶標生物、環(huán)境等造成危害。

1 手性農(nóng)藥

農(nóng)藥是指用于預防、控制或消滅病、草、蟲等有害生物及有目的地調(diào)節(jié)植物生長的化學合成品，或源自生物、其他天然物質(zhì)的一種物質(zhì)或幾種物質(zhì)的混合產(chǎn)物及其制劑[7]。手性是指物質(zhì)本身與其鏡像分子呈左右手對稱但又不能重疊的關系，是一種普遍存在的現(xiàn)象，組成生命體的必需氨基酸、蛋白質(zhì)等都有手性特征[8]。C原子是最常見的手性中心，連有4個不同原子或官能團的C原子為手性碳或為不對稱碳，N、P、S等原子也可形成手性中心[9]。含一個或一個以上的手性中心，有一對或是多對對映體的農(nóng)藥為手性農(nóng)藥。手性農(nóng)藥的表示方法[10]：(1)以R、S來表示手性物質(zhì)中手性原子的空間結(jié)構(gòu)，R代表順時針方向，S代表逆時針方向；(2)使平面偏振光右旋的是右旋體(以“+”表示)，反之則是左旋體(以“-”表示)，等量的左右旋體組成的物質(zhì)為外消旋體(旋光度為0)(以“±”表示)；(3)以D-(+)-甘油醛與L-(-)-甘油醛為標準確定分子的構(gòu)型。

2 手性農(nóng)藥的分類

2.1 擬除蟲菊酯類

擬除蟲菊酯類(Synthetic Pyrethroids)農(nóng)藥是廣泛使用的手性殺蟲劑[11]，具有高藥效、殺蟲譜廣、低殘留、易降解等特點[12]。擬除蟲菊酯農(nóng)藥作用機制是通過作用于神經(jīng)系統(tǒng)的軸突膜，與鈉通道相互作用而影響電脈沖的傳遞[13]。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥幾乎不溶于水[14]，由于其有機氯、有機磷等農(nóng)藥的毒性較大，所以逐漸被擬除蟲菊酯類代替[15]，其大多含有1～3個手性中心[16]，主要有溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯、胺菊酯等。

2.2 有機氯

有機氯(Organochlorine Pesticides，OCPs)農(nóng)藥較難分解、化學性質(zhì)穩(wěn)定、易溶于脂肪和有機溶劑、不易溶于水[17]。有機氯農(nóng)藥因其高效性而被廣泛使用，但其脂溶性強，能通過食物鏈富集于生物體中，進而威脅人類健康，具有免疫系統(tǒng)毒性、致癌、影響生殖與發(fā)育等毒副作用[17-18]。手性有機氯農(nóng)藥有狄氏劑、滴滴涕(DDT)、毒殺芬等。

2.3 有機磷

有機磷(Organophosphate Pesticide，OPPs)農(nóng)藥的作用機制是能夠抑制目標物的乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，防止乙酰膽堿的水解，造成乙酰膽堿堆積，殘留在水果、蔬菜中的有機磷農(nóng)藥在進入人體后會對人類產(chǎn)生潛在的毒性影響[19]，如神經(jīng)系統(tǒng)毒性、內(nèi)臟器官毒性、生殖系統(tǒng)毒性等[20]。有機磷農(nóng)藥一般不溶于水，但溶于動植物油和有機溶劑，對光、熱、氧較穩(wěn)定，遇堿易分解，一般情況下殘效期較短[21]，被禁用的有機磷包括甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷和磷胺[22]。目前，批準使用的有機磷農(nóng)藥至少有30%含有1個手性中心[23]。手性有機磷農(nóng)藥主要分為磷手性(如滅蠅磷、丙溴磷等)、碳手性(如敵百蟲、馬拉硫磷等)、硫手性(如豐索磷等)；還有碳和磷2個手性中心，如噻唑磷、氯胺磷等。

2.4 三唑類

三唑類(Triazoles)農(nóng)藥具有1,2,4-三唑結(jié)構(gòu)，大部分有1個或2個手性中心[24]，80%以上為手性農(nóng)藥[8]，其是應用廣泛的殺菌劑，通過抑制原菌細胞膜的C14脫甲基甾醇的合成而具有活性[25]，有高活性、殺菌快速、殺菌譜廣、強內(nèi)吸性、低毒性等特點[26]。三唑類農(nóng)藥主要有丙環(huán)唑、三唑醇、戊唑醇、腈菌唑等。

2.5 除草劑

除草劑(Herbicide)是專門針對雜草、保護農(nóng)作物的一類農(nóng)藥。根據(jù)化學結(jié)構(gòu)將手性除草劑主要分為芳氧羧酸類(如禾草靈、炔草酯)、酰胺類(如甲草胺、雙酰草胺)、咪唑啉酮類(如咪唑煙酸、咪唑喹啉酸)、環(huán)己烯酮類(如禾草滅、稀草酮)、尿嘧啶類(如炔草隆、除草定)、三嗪類(如密草通、三嗪氟草胺)[27-28]。

3 植物源食品中手性農(nóng)藥的檢測

3.1 液相色譜法

液相色譜法適合于極性大、不耐熱、不易揮發(fā)的物質(zhì)，其分析速度快、進樣量大，具有操作方便、重現(xiàn)性好、樣品無需汽化、分析條件溫和等特點。調(diào)節(jié)流動相的不同比例可實現(xiàn)對樣品進行梯度洗脫分離，常與紫外檢測器、質(zhì)譜(MS)等多種檢測器聯(lián)用。液相色譜有正向色譜模式與反向色譜模式類型，正相色譜流動相包含烷烴(如正己烷)與醇改性劑(通常是乙醇或異丙醇)，反向色譜流動相為水或含水緩沖液與有機溶劑改性劑(通常為甲醇或乙腈)[1]，正相高效液相色譜比反相高效液相色譜有更高的分離效率[29]，但反相高效液相色譜因背景信號強度更低、樣品制備過程更簡單等優(yōu)點，在手性分離中的應用發(fā)展迅速[1]。劉一平等[30]以(Chiralcel OD-H)手性色譜柱實現(xiàn)了對高效氯氟氰菊酯的拆分。Gao等[31]在反相液相色譜模式下拆分了甲基異柳磷，并建立了HPLC-UV檢測法，可同時測定蔬菜、水果和土壤中手性農(nóng)藥甲基異柳磷的對映選擇性方法，對映體在0.25～20 mg/L范圍內(nèi)線性良好，LOD為0.008～0.011 mg/kg，LOQ為0.027～0.037 mg/kg，平均回收率為83.2%～110.9%，且甲基異柳磷在小白菜中的立體選擇性降解表明，(R)-(-)甲基異柳磷異構(gòu)體的降解速度比(S)-(+)-異構(gòu)體(t1/2=1.9 d)快。Sun等[32]對吡氟氯禾靈進行拆分，并建立環(huán)境基質(zhì)(如土壤和水)中吡氟氯禾靈對映體的手性殘留分析方法，吡氟氯禾靈的對映體在0.50～201.04 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，土壤LOD為0.005 mg/kg，平均回收率為84%～90%；水LOD為0.001 mg/L，平均回收率為89%～101%。Shi等[33]建立了手性液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜分析水稻、稻殼與糙米中茚蟲威對映體的方法，茚蟲威在0.025～2.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，LOD為0.07～0.8 μg/kg，LOQ為6.25～25 μg/kg，平均回收率為74.00%～102.61%，通過研究茚蟲威在貴州與湖南的水稻的降解行為表明S-茚蟲威優(yōu)先降解且不會發(fā)生對映體的轉(zhuǎn)化，茚蟲威在糙米中的殘留濃度低于水稻植株與稻殼中的殘留濃度。張春艷等[34]建立了反相高效液相色譜拆分氟環(huán)唑?qū)τ丑w的方法，并建立了氟環(huán)唑?qū)τ丑w在蔬菜水果及土壤中的殘留分析方法，在0.1～10.0 mg/L之間氟環(huán)唑?qū)τ丑w的線性關系良好，LOQ為0.05 mg/kg，平均回收率為80.8%～96.7%。Yao等[35]對水胺硫磷及其代謝產(chǎn)物水胺氧磷進行拆分，并建立了手性高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定大米、土壤與水中的水胺硫磷及其主要代謝物水胺氧磷的方法，在1～500 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好。水中LOD為0.1 μg/kg、大米和土壤為0.5 μg/kg；水中LOQ為0.5 μg/kg、大米和土壤為5 μg/kg，平均回收率分別為89.7～103%和90.1～98.7%。曾春等[36]對粉唑醇對映體進行拆分，并建立了快速測定粉唑醇對映體在香蕉中的殘留量的方法，0.5～125 mg/L范圍均具有良好的線性關系，平均加標回收率為93.4%～101.7%。張利強等[37]對手性苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w的進行了拆分，并建立了苯醚甲環(huán)唑在火龍果中殘留的分析方法，單個對映體在0.10～10 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，在0.4 mg/kg和2.8 mg/kg的外消旋苯醚甲環(huán)唑加標水平下，4個對映體的平均回收率分別為83.7%～99.3%與86.4%～91.6%。廖玉芹等[38]采用反向液相色譜模式下拆分了己唑醇、粉唑醇、滅菌唑、烯唑醇4種三唑類手性農(nóng)藥對映體，并建立了測定滅菌唑?qū)τ丑w在黃瓜中殘留的方法，滅菌唑?qū)τ丑w在1～50 μg/mL范圍內(nèi)的線性關系良好，滅菌唑第一個對映體的加標平均回收率為92.54%，第二個對映體的加標平均回收率為93.16%，黃瓜中兩對映體的LOD小于20 μg/kg。駱沖等[39]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析菜心與油麥菜中手性農(nóng)藥多效唑、腈菌唑、甲霜靈、三唑酮與噁唑菌酮的方法，5種手性農(nóng)藥在0.005～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，LOD為0.005 mg/kg，LOQ為0.01 mg/kg，平均回收率為68.8%～104.0%。張宏福[40]對手性三唑類農(nóng)藥己唑醇進行了拆分，并建立蘋果中己唑醇殘留分析的方法，己唑醇在0.5～125 μg/mL濃度范圍內(nèi)對映體的線性關系良好，己唑醇兩對映體的平均回收率為88.0%～97.2%。表1列舉了液相相色譜法分離手性農(nóng)藥的分析方法。

表1 液相色譜法分析手性農(nóng)藥對映體

3.2 氣相色譜法

氣相色譜法與高效液相色譜相比，氣相色譜更適合非極性、熱穩(wěn)定性良好、易于揮發(fā)的物質(zhì)，其具有進樣量小、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點。Wang等[41]建立氣質(zhì)聯(lián)用測定蔬菜中乙酰甲胺磷與甲胺磷對映體的分析方法，結(jié)果顯示對映體在蔬菜中的代謝是有選擇性的，采用QuEChERS方法對蔬菜進行前處理，在蔬菜中的平均回收率為71.87%～81.45%，相對標準偏差小于8.81%。潘蓉等[42]建立了茶葉中乙酰甲胺磷和甲胺磷對映體的拆分及分析方法，茶葉中甲胺磷回收率在58.3%～66.4%之間，乙酰甲胺磷在50.8%～57.6%之間，在綠茶基質(zhì)中甲胺磷和乙酰甲胺磷的檢出限有所不同，實驗發(fā)現(xiàn)(+)-乙酰甲胺磷的降解略比(-)-乙酰甲胺磷快，乙酰甲胺磷在降解過程中更易產(chǎn)生(+)-甲胺磷。Natalia Fidalgo-Used等[43]建立了2種分析河水、果汁等樣品中育畜磷的方法。研究發(fā)現(xiàn)ECD、ICP-MS兩種檢測器中ICP-MS比ECD的選擇性好、靈敏度高，2種檢測器在檢測限濃度～250 ng/mL范圍內(nèi)，線性良好，加標回收率約83%以上。戴守輝等[44]建立了測定蓮藕及泥底的PCB方法，在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好，加樣回收率在82.8%～117%之間，在市售蓮藕樣品未檢出6種手性農(nóng)藥，但污染區(qū)蓮藕、荷莖和荷葉中PCB95-1、PCB91-2和(+)-PCB136含量均高于其對應的對映體含量，其余的手性PCB兩個對映體濃度則相接近。Li等[45]建立了分析測定谷物及果蔬中硅氟唑的方法，在10～5000 μg/kg范圍內(nèi)，線性良好，硅氟唑的回收率大于86.7%。表2列舉了氣相色譜法分離手性農(nóng)藥的分析方法。

3.3 毛細管電泳法

毛細管電泳(CE)又稱高效毛細管電泳(HPCE)[46]，毛細管電泳是一類以高壓直流電場為驅(qū)動力，毛細管為分離通道的新型分離分析技術(shù)，樣品中各組分的淌度與分配行為存在差異而實現(xiàn)分離，是微柱分離與經(jīng)典電泳相結(jié)合的技術(shù)[47]。CE通常使用手性添加劑構(gòu)建手性環(huán)境來實現(xiàn)對映體的分離，對映體與手性選擇劑的結(jié)合常數(shù)存在差異，而導致對映體的表觀淌度的不同，所以可用CE進行分離[48]。根據(jù)分離模式的不同可將CE分為毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管電色譜(CEC)、毛細管等速電泳(CITP)、毛細管凝膠電泳(CGE)及膠束電動毛細管色譜(MEKC)等[49-50]。劉銀[49]采用環(huán)糊精(β-CD)-毛細管區(qū)帶電泳(CZE)法在緩沖液25 mmol/L磷酸鹽-20 mmol/L β-CD(pH=12.5)條件下拆分稀草酮、吡喃草酮、滅草喹、甲氧咪草煙，同時以二元環(huán)糊精為手性添加劑，以50%甲醇-50%水為樣本溶劑，在緩沖液為40 mmol/L丙基環(huán)糊精(HP-β-CD)-10 mmol/L 2,6-二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)-90 mmol/L十二烷基磺酸鈉(SDS)-25 mmol/L硼砂-10%乙腈(pH=8.5)情況下用毛細管膠束電動色譜法(MECC)成功拆分了粉唑醇、滅菌唑、氟環(huán)唑與乙螨唑?qū)τ丑w。張夢薇[48]以40 mmol/L γ-CD-75 mmol/L H3PO4-100 mmol/L SDS(pH=2.0)的緩沖溶液，采用毛細管電泳膠束電動色譜(MEKC)拆分2-苯氧基丙酸(2-PPA)、2-(4-氯苯氧基)丙酸(2,4-CPPA)、2-(3-氯苯氧基)丙酸(2，3-CPPA)、2,4-滴丙酸(Dichlorprop)、2,4,5-涕丙酸(Silvex)。張宏福等[51]采用毛細管電色譜(CEC)方法，以磺丁基醚-β-環(huán)糊精開管毛細管柱(SECDP)為電色譜柱，3 mmol/L-(SBE-β-CD)-15%(體積分數(shù))甲醇-10 mmol/L的硼酸鹽(pH=9.2)對粉唑醇進行拆分，并建立了果蔬(黃瓜、梨、蘋果與番茄)中粉唑醇分析檢測殘留的方法，粉唑醇對映體在1.3～250 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良，LOD為25 μg/kg，第一對映體回收率為94.6%～95.8%，第二對映體回收率94.5%～98.6%。李佳等[52]采用高效毛細管電泳(HPCE)在15976 mg/L DM-β-CD-5332.0 mg/L乙酸緩沖溶液(pH=5.8)條件下，實現(xiàn)了精喹禾靈對映體的拆分，該方法可用于精喹禾靈的定性定量分析。陳巧梅等[53]采用毛細管加壓電色譜(pCEC)對烯效唑、烯唑醇和丙環(huán)唑?qū)崿F(xiàn)了同時拆分，色譜柱為C18硅烷化修飾的亞微米SiO2微球裝填成毛細管色譜柱，以20 mmol/L羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)-乙腈-20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)(45/55，v/v)為流動相，施加電壓-9.4 kV，在12 min內(nèi)烯效唑、烯唑醇及丙環(huán)唑依次得到分離。虞婕等[54]以5 mmol/L β-CD-2.5%異丙醇-75 mmol/L NaH2PO4-5 mmol/L NH4H2PO4為緩沖溶液，在20 min內(nèi)實現(xiàn)了對抑霉唑?qū)τ丑w的拆分。Angeles等[55]通過毛細管膠束電動色譜(MEKC)對生物丙烯菊酯殺蟲劑進行立體選擇性分離，對映體在6.5 min內(nèi)完成分離，且分離度大于1.5。且外消旋體對綠藻的毒性大于S異構(gòu)體，外消旋體與S-生物丙烯菊酯會抑制高粱種子的萌芽。表3列舉了毛細管電泳分析手性農(nóng)藥對映體的檢測方法。

表3 毛細管電泳分析手性農(nóng)藥對映體

4 小結(jié)

手性農(nóng)藥其空間構(gòu)型不同，藥效作用、降解時間、毒性大小等都有較大的差異，為了更好地發(fā)揮農(nóng)藥的藥效，最大程度地減小其對非靶向目標物等的毒害作用，建立手性農(nóng)藥的拆分及對其殘留量進行分析檢測有充分的必要性。當前已有很多先進的技術(shù)手段被用到了植物源性食品中手性農(nóng)藥的拆分與殘留檢測，如GC與LC。LC與GC通常用手性柱實現(xiàn)對手性農(nóng)藥的拆分，但手性柱的經(jīng)濟成本較高，且GC拆分手性農(nóng)藥的分析時間偏長，通常情況下，一個特定的手性柱只能拆分某一種或某幾種手性農(nóng)藥，因此其應用有較大的限制性，實用性較差。GC對手性農(nóng)藥的拆分要求其耐高溫、有揮發(fā)性等。如若是非揮發(fā)性手性農(nóng)藥則還需要衍生，在高溫情況下手性農(nóng)藥對映體還有可能會相互轉(zhuǎn)化等[28]，則就失去了原本分離分析的意義。LC要求手性農(nóng)藥熱穩(wěn)定性差、不宜揮發(fā)、極性大等。CE作為近年來發(fā)展的分離技術(shù)，與GC、LC相比,CE具有分離效率高、分析速度快、樣品用量小(nL級～fL級)、溶劑與試劑消耗量少、運行成本低、分離模式多、綠色環(huán)保等優(yōu)點[56]。但與LC、GC相比,CE對檢測器的靈敏度要求高，重現(xiàn)性差，其實際應用會有所限制。除了以上的技術(shù)用于手性農(nóng)藥殘留的分析檢測之外，還有其他的檢測技術(shù)，比如超臨界流體色譜(SFC)，以固體吸附劑或鍵合到載體(或毛細管)的高聚物為固定相，超臨界超臨界流體(常用超臨界CO2)與少量有機溶劑作為流動相的色譜，有機試劑耗量小，綠色環(huán)保經(jīng)濟，柱效高，分析時間短[57-58]。徐明仙等[59]以Sino-Chiral OJ為手性固定相，用SFC對氯菊酯、氰戊菊酯、聯(lián)苯菊酯等6種手性農(nóng)藥進行拆分。超高效合相色譜以超臨界CO2與一定量甲醇、乙腈等溶劑(助溶作用)作為流動相，利用超臨界流體的溶劑化能力來實現(xiàn)物質(zhì)的分離分析，對于GC而言，其可分析難揮發(fā)、受熱不穩(wěn)定、高沸點的物質(zhì)，與傳統(tǒng)流動相相比其傳質(zhì)效率更高[60-61]。張文華等[62]利用UPC2實現(xiàn)了三唑酮、三唑醇、己唑醇等手性農(nóng)藥的拆分，并建立了其在黃瓜中的殘留量的檢測方法。

植物源性食品的安全關乎人體健康與生命安全，手性農(nóng)藥品種較多，而植物源性食品基質(zhì)也比較復雜，當前還沒有一種拆分技術(shù)可以將所有手性農(nóng)藥同時拆分，也沒有一種分析檢測方法可以將所有殘留于植物源性食品中手性農(nóng)藥定量檢出。因此研究可同時拆分多種手性農(nóng)藥的技術(shù)，以及準確、簡捷、高效、快速、靈敏測定植物源性食品中手性農(nóng)藥多殘留的方法將是手性農(nóng)藥殘留檢測的關鍵所在。