黃芪和力智能低溫高效提取技術(shù)過(guò)程控制的指紋圖譜研究

蘇雨苗，宋力飛，劉常青，陳麗宜

（1.廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州 510700；2.廣州中澤生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 510700）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membra‐naceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。春、秋二季采挖，除去須根和根頭，曬干。性甘，微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效，用于氣虛乏力、食少便澹、中氣下陷、久瀉脫肛等[1]。

中藥材資源是中醫(yī)藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，其質(zhì)量事關(guān)臨床用藥的安全性與有效性，但目前中藥材的種子、種苗、種植、采收加工、飲片炮制等相關(guān)技術(shù)規(guī)范及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，如何科學(xué)評(píng)價(jià)是中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化以及國(guó)際化的前提條件[2-3]。近年來(lái)，中藥指紋圖譜的應(yīng)用極大地促進(jìn)了基于藥效成分評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的科學(xué)性及相應(yīng)有效成分群的發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用現(xiàn)代儀器分析手段和方法研究分析中藥的質(zhì)量和藥效，對(duì)保證臨床用藥的安全性和有效性具有重要的指導(dǎo)意義[4-6]。與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的中藥指紋圖譜，用能體現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的化學(xué)物質(zhì)群來(lái)綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，符合中醫(yī)藥理論，是國(guó)內(nèi)外認(rèn)可的中藥質(zhì)量控制的有效手段[7-8]。

本研究采用和力智能低溫高效提取技術(shù)（HHLSE）對(duì)黃芪進(jìn)行提取，并運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)對(duì)黃芪提取工藝過(guò)程進(jìn)行跟蹤，通過(guò)比對(duì)原材及不同中間品之間物質(zhì)群的轉(zhuǎn)移情況，能更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)提取過(guò)程的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)，為中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

和力智能低溫高效提取成套設(shè)備（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司）；LC-10AT VP PLUS高效液相色譜儀（島津）；TB-114電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

黃芪（批號(hào)：T20210301）采購(gòu)自天一藥業(yè)有限公司，經(jīng)本公司宋力飛高級(jí)工程師依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》檢驗(yàn)為合格品；芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)201906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，北京儀化通標(biāo)科技有限公司）；甲醇（分析純，批號(hào)20201022，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；乙腈（色譜純，批號(hào)R141915，北京迪科馬科技有限公司）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)202008，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，中國(guó)食品與藥品檢定研究院）；磷酸（分析純，批號(hào)20200105，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪原材的HHLSE提取

取黃芪原材20 kg，粉碎后進(jìn)行HHLSE提取、分離、濃縮、精制，提取過(guò)程中對(duì)系列中間產(chǎn)品進(jìn)行取樣。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷3 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取黃芪藥材粉末及各個(gè)中間品約6 g，精密稱定，加入60 mL甲醇超聲40 min，濾過(guò)，殘?jiān)?0 mL甲醇超聲20 min，合并濾液，揮發(fā)至近干（65℃），殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，靜置4 h，微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 色譜條件

通過(guò)UV檢測(cè)器對(duì)200~400 nm段進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到254 nm出峰數(shù)量較多，信號(hào)響應(yīng)值大，基線平穩(wěn)，故而選用254 nm為黃芪指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)；色譜柱為Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水（pH=2.62）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~17 min，8%→19%B；18~30 min，19%→21%B；31~35 min，21%→23%B；36~45 min，23%→25%B；46~50 min，25%→28%B；51~60 min，28%→45%B；61~70 min，45%→56%B）。

黃芪原材指紋圖譜如圖1所示，可見(jiàn)，黃芪原材藥粉的色譜峰面積較大且分離度較好的有10個(gè)色譜峰，可作為黃芪指紋圖譜的共有峰。其中，3號(hào)峰經(jīng)檢測(cè)確定為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，10號(hào)峰經(jīng)檢測(cè)確定為芒柄花素。

圖1 黃芪原材指紋圖譜Figure 1 Fingerprint of raw material of A.membranaceus

2.5 黃芪指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一批黃芪原材的供試品溶液15 μL，按照“2.4”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均在2%以下，相對(duì)峰面積RSD值在5%以下，色譜圖相似度達(dá)到0.950以上，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批黃芪藥粉6份，分別按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均在2%以下，相對(duì)峰面積RSD值在5%以下，色譜圖相似度達(dá)到0.950以上，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批黃芪原材的供試品溶液15 μL，分別在制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，按照“2.4”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均在2%以下，相對(duì)峰面積RSD值在5%以下，色譜圖相似度達(dá)到0.950以上，表明供試品溶液在常溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 黃芪提取過(guò)程各中間品指紋圖譜的測(cè)定

分別取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液，黃芪原材藥粉、HHLSE提取工藝過(guò)程的提取液、離心液、三足離心渣、高速離心渣、微濾濃液、微濾清液、膜濃液、膜洗液及膜清液，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別按“2.4”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”計(jì)算各中間品指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

圖2 黃芪提取各中間品指紋圖譜對(duì)比Figure 2 Comparison of fingerprints of the intermediate products extracted from A.membranaceus

表1 黃芪提取過(guò)程各中間品指紋圖譜相似度對(duì)比Table 1 Comparison of the similarity of fingerprints of each intermediate product in the extraction process of A.membranaceus

可見(jiàn)，黃芪原材及不同中間品的指紋圖譜色譜行為不盡相同。其中，膜濃液、膜洗液與黃芪原材相似度均在0.950以上，提取液、離心液、三足離心渣、高速離心渣、微濾濃液、微濾清液及膜清液與黃芪相似度則在0.900以下，表明黃芪HHLSE提取過(guò)程中，物質(zhì)群在不同的工藝階段變化是不一致的，膜濃液、膜清液的相似度分別為0.955、0.431；通過(guò)不同工序的指紋圖譜比較，可以直觀地看到大多數(shù)物質(zhì)群富集于黃芪膜濃液、膜洗液中。

3 討論

本研究考察了乙腈-水、甲醇-水及乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，峰形較好，基線平穩(wěn)，出峰數(shù)量多，分離度較高，因此確定以乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相系統(tǒng)。通過(guò)UV檢測(cè)器對(duì)200~400 nm段進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到254 nm波長(zhǎng)下出峰數(shù)量較多，信號(hào)響應(yīng)值大，基線平穩(wěn)，故254 nm可作為黃芪指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。此外，還對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了比較優(yōu)化，最終確定為“2.4”項(xiàng)的色譜條件，該方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好。黃芪的10個(gè)共有峰中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷所占峰面積最大，具有明顯特征，故而選擇為參照峰。

HHLSE提取工藝是在室溫下對(duì)物料進(jìn)行提取，能很好地保留原藥材的物質(zhì)成分及風(fēng)味，使得最終產(chǎn)物能很好地保留物料的原特征[9-10]。黃芪HHLSE提取過(guò)程中，經(jīng)過(guò)粉碎、提取、分離、精制、濃縮等相應(yīng)工序，黃芪原材及不同中間品的指紋圖譜色譜行為不盡相同。其中，膜濃液、膜洗液與黃芪原材相似度均在0.950以上，膜濃縮液經(jīng)過(guò)精制、濃縮等工藝，有效成分得以富集，保留了原材的物質(zhì)成分及風(fēng)味；提取液、離心液、三足離心渣、高速離心渣、微濾濃液、微濾清液及膜清液與黃芪相似度則在0.900以下。黃芪提取液由于加純水提取稀釋，物質(zhì)群與原材相較有一定差異。通過(guò)不同工序的指紋圖譜比較，可以直觀地觀察到物質(zhì)群在不同的工藝階段變化是不一致的，大多數(shù)物質(zhì)群最終富集于黃芪膜膿液、膜洗液中。

本研究以指紋圖譜為技術(shù)手段，對(duì)黃芪的HHLSE提取工藝過(guò)程進(jìn)行研究，可以直觀地觀察到物質(zhì)群各個(gè)工藝階段的轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而對(duì)提取過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，為黃芪提取過(guò)程的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持，為中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展及新型提取工藝研究提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。