運(yùn)動(dòng)調(diào)控高鹽膳食果蠅運(yùn)動(dòng)能力和生命周期的機(jī)制
——基于Salt與Foxo基因過表達(dá)

文登臺(tái)，后文其，郗增輝，翟帥帥

（魯東大學(xué)體育學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025）

適量用鹽（主要為NaCl）能改善人體生理功能，如維持神經(jīng)、肌肉的正常興奮性等［1］。但長期過量攝入食用鹽將誘發(fā)高血壓、胃癌、糖尿病、心力衰竭等多種重大慢性疾病，并使死亡率增加［2-3］。世界衛(wèi)生組織推薦每天食用鹽的攝入量應(yīng)不多于5 g，而我國居民每天食用鹽攝入量高達(dá)13.5 g，是世界衛(wèi)生組織推薦量的2.5倍多。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［4］發(fā)現(xiàn)，高鹽膳食能抑制大鼠骨骼肌血管的生成，導(dǎo)致骨骼肌收縮功能障礙，其主要機(jī)制與骨骼肌的氧化應(yīng)激增加有關(guān)。運(yùn)動(dòng)鍛煉是全世界公認(rèn)的、能有效促進(jìn)健康的方式之一，能預(yù)防或減輕許多慢性疾病并提高生存率［5］。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)鍛煉能促進(jìn)人體骨骼肌血管生成，提高骨骼肌的抗氧化能力，從而增強(qiáng)骨骼肌的收縮功能。但長期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與高鹽攝入共存時(shí)，前者能否有效對抗后者誘發(fā)的壽命縮短和運(yùn)動(dòng)能力降低，這一問題仍有待明確，相關(guān)的分子機(jī)制也需進(jìn)一步闡明。

果蠅是遺傳學(xué)研究的經(jīng)典模式生物，在果蠅中發(fā)現(xiàn)的許多信號分子通路及基因功能與哺乳動(dòng)物及人具有同源性［7］，且其與哺乳動(dòng)物一樣對運(yùn)動(dòng)和營養(yǎng)具有保守性，因此，果蠅逐漸被運(yùn)用于運(yùn)動(dòng)與肥胖、運(yùn)動(dòng)與衰老、運(yùn)動(dòng)與心肌病的分子機(jī)制研究［8-11］。果蠅鹽（Salt）基因與人類溶質(zhì)載體家族5成員12（Solute Carrier Family 5 member 12，SLC5A12）基因?qū)偻椿?，兩者在功能上具有保守性，能編碼鈉-溶質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體。研究［12-13］表明：果蠅高鹽膳食后壽命縮短，其主要機(jī)制與高鹽誘發(fā)果蠅Salt基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)；果蠅Salt基因過表達(dá)也能造成壽命縮短，這與高鹽膳食效應(yīng)類似；Salt基因敲減能增加高鹽膳食果蠅的存活率。因此，研究提示，Salt基因是調(diào)控鹽耐受性的關(guān)鍵基因，但其在運(yùn)動(dòng)抵抗高鹽中發(fā)揮的作用仍不清楚。

本文首先對野生型果蠅進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和高鹽膳食干預(yù)，通過檢測果蠅運(yùn)動(dòng)能力、壽命和骨骼肌超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力水平、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平、Salt基因及叉頭轉(zhuǎn)錄因子O（transcription factor of the forkhead box class O，F(xiàn)oxo）基因表達(dá)情況，初步分析運(yùn)動(dòng)抵抗高鹽應(yīng)激誘發(fā)果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命損害的分子機(jī)制；然后，通過上游激活序列（Upstream Active Sequence，UAS）/半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件（galactose-regulated upstream promoter element，Gal4）系統(tǒng)構(gòu)建Salt基因、Foxo基因過表達(dá)模型，進(jìn)一步研究Salt基因與Foxo/SOD通路在運(yùn)動(dòng)抵抗高鹽應(yīng)激中的作用，旨在為高鹽攝入群體的運(yùn)動(dòng)健身提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

野生型w1118（品系號：3605）、arm-Gal4（品系號：39249）、Salt-UAS-過表達(dá)型（品系號：58888）和Foxo-UAS-過表達(dá)型（品系號：9575）4種品系果蠅均來自伯明頓果蠅品系中心（Bloomington Drosophila Stock Center）。將含UAS和Gal4序列不同品系的果蠅雜交，構(gòu)建UAS/Gal4系統(tǒng)，對目的基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控［14］。所有果蠅放置在恒溫25℃、恒濕50%、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 雜交及分組

將雄性野生型w1118、Salt-UAS-過表達(dá)型（基因型：w*；TI｛TI｝miR-1014KOSaltmiR-1014-KO）、Foxo-UAS-過表達(dá)型（基因型：y1w*；P｛UAS-Foxo.P｝2）果蠅分別與雌性arm-Gal4果蠅雜交，收集的F1代羽化12 h內(nèi)的雄蠅分別是基因正常表達(dá)（arm-Gal4>w1118）、Salt過表達(dá)（arm-Gal4>Salt-UAS-過表達(dá)）和Foxo過表達(dá)（arm-Gal4>Foxo-UAS-過表達(dá)）果蠅（圖1）。其中：arm-Gal4>w1118果蠅分為對照組、高鹽組、運(yùn)動(dòng)組和高鹽運(yùn)動(dòng)組；arm-Gal4>Salt-UAS-過表達(dá)果蠅分為Salt組和Salt+運(yùn)動(dòng)組；arm-Gal4>Foxo-UAS-過表達(dá)果蠅分為Foxo組和Foxo+高鹽組。共8組，每組350只果蠅，共2 800只。

圖1 果蠅雜交及分組示意Figure 1 Diagram of Drosophila hybridization and grouping

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

利用果蠅逆重力攀爬特性，使其在運(yùn)動(dòng)平臺(tái)（自主研發(fā)，專利號：ZL201920960000.4）上進(jìn)行攀爬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。試管固定于試管夾上并與地面垂直，此時(shí)果蠅做垂直于地面的攀爬運(yùn)動(dòng)，當(dāng)果蠅爬到試管頂部時(shí)，試管自動(dòng)翻轉(zhuǎn)180°，果蠅又回到試管底部，繼續(xù)攀爬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（圖2），攀爬時(shí)的負(fù)重等于果蠅體質(zhì)量。運(yùn)動(dòng)組果蠅均放到運(yùn)動(dòng)裝置上，每管20只，果蠅每次翻轉(zhuǎn)至試管底部后，給予10 s做向上攀爬運(yùn)動(dòng)，試管長約8 cm，每天運(yùn)動(dòng)1.5 h，每周連續(xù)運(yùn)動(dòng)干預(yù)5 d，休息2 d，持續(xù)運(yùn)動(dòng)干預(yù)2周，在第2周齡末檢測各指標(biāo)。通過觀察果蠅攀爬過程中能否跟上翻轉(zhuǎn)速度，以及是否保持逆重力攀爬和趨光特性來判斷是否產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞。由于逆重力攀爬是果蠅自發(fā)的運(yùn)動(dòng)，且運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間達(dá)到1.5 h才產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象，因此，國內(nèi)外學(xué)者將其定義為果蠅耐力運(yùn)動(dòng)［10-11］。

圖2 果蠅運(yùn)動(dòng)平臺(tái)和攀爬訓(xùn)練示意Figure 2 Schematic diagram of Drosophila exercise platform and climbing training

1.4 正常膳食和高鹽膳食配制

（1）正常膳食：在鍋中加入水、黃豆粉、酵母粉、玉米粉攪勻，并在加熱過程中加入瓊脂，直至溶液沸騰。沸騰后停止加熱，冷卻過程中加入蔗糖和麥芽糖，待蔗糖和麥芽糖充分溶解后，加入防腐劑丙酸和對羥基苯，充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶盅b于潔凈的培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基厚度約為0.5 cm。

（2）高鹽膳食：在正常食物配制過程中加入2%的食用鹽（99%NaCl），充分溶解。

（3）膳食方案：從第2天齡開始，將高鹽組果蠅從正常食物中轉(zhuǎn)移至高鹽食物中飼養(yǎng)，直至果蠅死亡。對于正常膳食果蠅和高鹽膳食果蠅，每天早晚向試管壁加入0.2 mL純凈水，供其飲用（圖3），相對于前人研究［12］中只喂食高鹽膳食而未提供飲用水，本實(shí)驗(yàn)的膳食條件為溫和的高鹽膳食。

圖3 高鹽膳食果蠅正在飲水Figure 3 Drosophila on a high-salt diet are drinking water

1.5 各指標(biāo)檢測方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorent Assay，ELISA）檢測果蠅SOD活力水平、MDA水平和ROS水平

每管取10只果蠅骨骼肌置于500μL磷酸鹽緩沖液中，用于檢測SOD活力水平、MDA水平和ROS水平，重復(fù)3次，共需30只果蠅。ELISA檢測步驟如下：用細(xì)胞破碎儀使果蠅骨骼肌細(xì)胞破裂，將勻漿液于4℃、2 504g離心15 min，取上清備用。于各標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；空白孔不加。除空白孔外，于標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱孵育60 min。棄去液體，于吸水紙上拍干；每孔加滿洗滌液（350μL）靜置1 min，甩去洗滌液，于吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。然后每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的光密度值。以所測標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為橫坐標(biāo)，濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，然后將樣品的光密度值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative Re?al-Time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）檢測基因信使核糖核酸（messenger Ribose Nu?cleic Acid，mRNA)表達(dá)情況

每管取10只果蠅骨骼肌，加入1 mL的TRIzol試劑提取總RNA，取2μL RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)DNA。以核糖體蛋白L32（Ribosomal Protein L32，Rp49）基因?yàn)閮?nèi)參照，利用美國Bio-Rad公司產(chǎn)96孔熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀、日本TaKaRa公司產(chǎn)RR820A SYBR?PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，并經(jīng)NCBI BLAST基因庫檢索驗(yàn)證，與其他基因無高度同源性。然后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物并純化，引物序列如下：Salt上游引物5′-TTAATCGCAGGCGCGTCAGTG-3′，下游引物5′-GGACGAGACCACCGTGTTAATCAG-3′；Foxo上游引物5′-AACAACAGCAGCATCAGCAG-3′，下游引物5′-CTGAACCCGAGCATTCAGAT-3′；Rp49上 游 引 物5′-CTAAGCTGTCGCACAAATGG-3′，下游引物5′-AACTTCTTG AA TCCGGTGGG-3′。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR?Premix Ex Taq?試劑15μL、上 游 引 物（10μmol/L）0.5μL、下 游 引 物（10μmol/L）0.5μL、參比染料0.6μL、cDNA模板5μL、雙蒸水8.4μL；總體系30μL，每個(gè)樣本分3個(gè)復(fù)孔，每孔10μL。PCR反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s、60℃30 s循環(huán)40次。每組重復(fù)3次，共需30只果蠅。PCR擴(kuò)增后用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并計(jì)算各組基因的mRNA相對表達(dá)量及過表達(dá)率。

1.5.3 電子顯微鏡觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)

將果蠅麻醉，去掉翅膀、頭部及腹部，將胸部放入固定液（含2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液）固定至少2 h，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次10～15 min。然后用1%鋨酸固定液固定1～2 h，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次10～15 min。用50%丙酮10～15 min、70%丙酮10～15 min、90%丙酮10～15 min、100%丙酮15～20 min（中途更換1次）進(jìn)行梯度脫水。用純丙酮+包埋液（體積比為1∶1）37℃12 h或純包埋液37℃10～12 h進(jìn)行浸泡和包埋。37℃烘箱內(nèi)過夜或60℃烘箱內(nèi)12～24 h固化。采用超薄切片機(jī)切片，層厚50～100 nm；用3%醋酸鈾及硝酸鉛進(jìn)行雙染色。使用HT-7700透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.5.4 運(yùn)動(dòng)能力檢測

每組取100只果蠅，每管20只果蠅，用NVGS400攝像機(jī)拍攝果蠅震落至培養(yǎng)管底部后負(fù)趨地性爬行的行為學(xué)特征，以果蠅攀爬高度評定果蠅運(yùn)動(dòng)能力，即將全部果蠅個(gè)體震落至試管底部后，測量出第2 s時(shí)所有果蠅的攀爬高度。

1.5.5 生命周期統(tǒng)計(jì)

每組取200只果蠅，每天18︰00—19︰00觀察和記錄果蠅死亡數(shù)，直到各組果蠅全部死亡為止，繪制果蠅存活曲線。全部果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為果蠅的平均壽命，平均壽命延長率＝（實(shí)驗(yàn)組平均壽命－對照組平均壽命）/對照組平均壽命×100%。統(tǒng)計(jì)各組果蠅平均壽命和平均壽命延長率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件和GraphPad Prism 8軟件分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，若方差齊則用參數(shù)檢驗(yàn)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，若方差不齊則用t’檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。果蠅存活率的比較采用非參數(shù)log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 果蠅Salt基因mRNA及抗氧化指標(biāo)的檢測結(jié)果

高鹽組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平高于對照組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為142.00%；運(yùn)動(dòng)組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；高鹽運(yùn)動(dòng)組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平低于高鹽組（P<0.05），相對過表達(dá)率約為-11.16%；Salt組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平高于對照組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為55.00%；Salt+運(yùn)動(dòng)組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平與Salt組相比無顯著性差異（P>0.05）；Foxo組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；Foxo+高鹽組果蠅Salt基因的mRNA表達(dá)水平低于高鹽組（P<0.05），相對過表達(dá)率約為-13.63%。見表1。

表1 Salt基因表達(dá)及氧化應(yīng)激各指標(biāo)檢測結(jié)果（xˉ±s）Table 1 Salt gene expression and oxidative stress index detection results（xˉ±s）

高鹽組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平低于對照組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為-58.00%；運(yùn)動(dòng)組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平高于對照組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為46.00%；高鹽運(yùn)動(dòng)組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平高于高鹽組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為69.05%；Salt組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平低于對照組（P<0.05），相對過表達(dá)率約為-18.00%；Salt+運(yùn)動(dòng)組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平高于Salt組（P<0.05），相對過表達(dá)率約為20.00%；Foxo組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平高于對照組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為67.00%；Foxo+高鹽組果蠅Foxo基因的mRNA表達(dá)水平高于高鹽組（P<0.01），相對過表達(dá)率約為278.00%。見表1。

高鹽組果蠅SOD活力水平低于對照組（P<0.01），MDA和ROS水平均高于對照組（P<0.01）；運(yùn)動(dòng)組果蠅SOD活力水平高于對照組（P<0.01），MDA和ROS水平均低于對照組（P<0.05、P<0.01）；高鹽運(yùn)動(dòng)組果蠅SOD活力水平高于高鹽組（P<0.01），MDA和ROS水平均低于高鹽組（P<0.01）；Salt組果蠅SOD活力水平低于對照組（P<0.01），MDA和ROS水平均高于對照組（P<0.01）；Salt+運(yùn)動(dòng)組果蠅SOD活力水平高于Salt組（P<0.05），MDA和ROS水平均低于Salt組（P<0.01）；Foxo組果蠅SOD活力水平高于對照組（P<0.01），MDA和ROS水平均低于對照組（P<0.01）；Foxo+高鹽組果蠅SOD活力水平高于高鹽組（P<0.01），MDA和ROS水平均低于高鹽組（P<0.01）。見表1。

2.2 果蠅運(yùn)動(dòng)能力檢測結(jié)果

對照組果蠅2 s攀爬高度大于高鹽組［P<0.01，圖4（a）］，高鹽組果蠅胸腔骨骼肌電子顯微鏡圖像顯示骨骼肌中肌原纖維遭受較嚴(yán)重的破壞（圖5）。運(yùn)動(dòng)組果蠅2 s攀爬高度大于對照組［P<0.05，圖4（b）］，果蠅骨骼肌中肌原纖維與對照組相比破壞減少（圖5）。高鹽運(yùn)動(dòng)組果蠅2 s攀爬高度大于高鹽組［P<0.01，圖4（c）］，果蠅骨骼肌中肌原纖維遭受的破壞明顯少于高鹽組（圖5）。對照組果蠅2 s攀爬高度與Salt組果蠅相比無顯著性差異［P>0.05，圖4（d）］，但Salt組果蠅骨骼肌中肌原纖維遭受的破壞比對照組嚴(yán)重（圖5）。Salt+運(yùn)動(dòng)組果蠅2 s攀爬高度大于Salt組［P<0.05，圖4（e）］，骨骼肌中肌原纖維破壞與Salt組相比較少（圖5）。Foxo組果蠅2 s攀爬高度大于對照組［P<0.01，圖4（f）］，骨骼肌中肌原纖維破壞與對照組相比較少（圖5）。Foxo+高鹽組果蠅2 s攀爬高度大于高鹽組［P<0.01，圖4（g）］，骨骼肌中肌原纖維破壞與高鹽組相比明顯減少（圖5）。

圖4 各組果蠅1周齡末2 s攀爬高度的比較Figure 4 Climbing height comparision of 1-week-old Drosophila in 2 secends

圖5 各組果蠅骨骼肌透射電子顯微鏡圖像結(jié)果Figure 5 Results of obvious transmission electron microscope image of Drosophila skeletal muscle

2.3 果蠅生命周期檢測結(jié)果

對照組果蠅的存活率高于高鹽組（P<0.01），對照組果蠅的平均壽命約為59 d，高鹽組果蠅的平均壽命約為47 d，高鹽組壽命縮短率為20.34%。高鹽運(yùn)動(dòng)組果蠅的存活率高于高鹽組（P<0.05），高鹽運(yùn)動(dòng)組果蠅的平均壽命約為53 d，高鹽組果蠅的平均壽命約為47 d，高鹽運(yùn)動(dòng)組壽命延長率為12.77%。運(yùn)動(dòng)組果蠅的存活率高于對照組（P<0.05），運(yùn)動(dòng)組果蠅的平均壽命約為65 d，對照組果蠅的平均壽命約為59 d，運(yùn)動(dòng)組壽命延長率為10.17%。對照組果蠅的存活率高于Salt組（P<0.01），對照組果蠅的平均壽命約為59 d，Salt組果蠅的平均壽命約為45 d，Salt組壽命縮短率為23.73%。Salt+運(yùn)動(dòng)組果蠅的存活率高于Salt組（P<0.05），Salt+運(yùn)動(dòng)組果蠅的平均壽命約為52 d，Salt組果蠅的平均壽命約為45 d，Salt+運(yùn)動(dòng)組壽命延長率為15.56%。Foxo組果蠅的存活率高于對照組（P<0.05），F(xiàn)oxo組果蠅的平均壽命約為64 d，對照組果蠅的平均壽命約為59 d，F(xiàn)oxo組壽命延長率約為8.47%。Foxo+高鹽組果蠅的存活率高于高鹽組（P<0.01），F(xiàn)oxo+高鹽組果蠅的平均壽命約為59 d，高鹽組果蠅的平均壽命約為47 d，F(xiàn)oxo+高鹽組壽命延長率為25.53%。見圖6。

圖6 果蠅存活率和平均壽命比較Figure 6 Comparison of survival results and mean lifespan in Drosophila

3 討論

3.1 耐力運(yùn)動(dòng)對高鹽膳食果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命的影響

研究［15］表明，在哺乳動(dòng)物中，高鹽膳食能減弱機(jī)體組織器官（如腎臟、心臟和大腦等）的抗氧化功能，增強(qiáng)氧化應(yīng)激及損傷，從而誘發(fā)疾病。此外，高鹽膳食能通過抑制血管緊張素Ⅱ和增強(qiáng)氧化應(yīng)激損害骨骼肌功能［4］。相反，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能促進(jìn)骨骼肌血液循環(huán)和提高抗氧化能力，從而提高骨骼肌收縮能力［6］。但運(yùn)動(dòng)鍛煉能否抵抗高鹽膳食對骨骼的損害，其分子機(jī)制如何，國內(nèi)外鮮有相關(guān)報(bào)道。

本文通過給予果蠅高鹽膳食和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)發(fā)現(xiàn)，高鹽膳食能明顯降低果蠅快速攀爬能力，并破壞骨骼肌的正常結(jié)構(gòu)。此外，本文結(jié)果還顯示，高鹽膳食不僅能誘發(fā)果蠅Salt基因表達(dá)上調(diào)，也減弱了機(jī)體的抗氧化能力，增加脂毒性物質(zhì)MDA，提升ROS水平；但通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，高鹽膳食果蠅的快速攀爬能力明顯提升，壽命得到顯著延長，Salt基因表達(dá)明顯下降，機(jī)體抗氧化能力明顯提高。這一結(jié)果提示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能明顯改善高鹽膳食對果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命的不利影響，其分子機(jī)制與Salt基因表達(dá)改善和機(jī)體抗氧化能力提高有關(guān)。Salt基因編碼的鈉-溶質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族的成員，參與機(jī)體對鹽分失調(diào)的應(yīng)答［16］。研究［17-18］證實(shí)，鹽敏感性與氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、超氧陰離子產(chǎn)生增加密切相關(guān)，高鹽攝入能激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，造成ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，其主要機(jī)制與高鹽攝入增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）氧化酶的活性使體內(nèi)超氧陰離子生成增多有關(guān)。在進(jìn)行有氧耐力鍛煉的過程中，機(jī)體會(huì)逐漸出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象，氧自由基逐漸產(chǎn)生，運(yùn)動(dòng)疲勞隨之而來。運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體通過一系列反應(yīng)來糾正內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞的狀態(tài)，包括不斷合成抗氧化因子SOD、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽（GSH）等，以及清除氧自由基和減少脂毒性損傷等。因此，運(yùn)動(dòng)鍛煉和適當(dāng)休息能使機(jī)體不斷經(jīng)歷“氧化應(yīng)激-自由基清除-一時(shí)性超量恢復(fù)-氧化應(yīng)激”這一循環(huán)過程。這種長期有規(guī)律的刺激導(dǎo)致機(jī)體抗氧化因子隨著每次的“一時(shí)性-適應(yīng)性增強(qiáng)”逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤俺志眯栽鰪?qiáng)”，包括使SOD活力水平升高及Foxo基因表達(dá)增加等［19-20］。因此，有規(guī)律的、適宜的運(yùn)動(dòng)鍛煉能提高機(jī)體的抗氧化能力，減少組織器官（包括骨骼肌、心臟和大腦等）的氧化損傷。

在果蠅中，氧化應(yīng)激增加是導(dǎo)致果蠅運(yùn)動(dòng)能力減弱、死亡率增加及衰老加快的主要原因［21］。研究［22］報(bào)道，果蠅進(jìn)行飛行訓(xùn)練后壽命顯著縮短，其主要原因是果蠅的飛行屬于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生大量氧自由基，這使氧化應(yīng)激超出果蠅承受和恢復(fù)的極限。相反，果蠅規(guī)律的攀爬運(yùn)動(dòng)已被國內(nèi)外學(xué)者證實(shí)能延長果蠅壽命，提高心臟功能和運(yùn)動(dòng)能力［23］。此外，果蠅規(guī)律的攀爬運(yùn)動(dòng)能減少高脂膳食帶來的脂質(zhì)堆積，減少脂毒性損傷，降低脂毒性心肌病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并延長生命周期［8］。其機(jī)制與規(guī)律運(yùn)動(dòng)提高果蠅SOD活力水平、增強(qiáng)Foxo基因表達(dá)、減少M(fèi)DA和ROS有關(guān)。因此，耐力運(yùn)動(dòng)能通過增強(qiáng)高鹽膳食果蠅的抗氧化能力和下調(diào)Salt基因表達(dá)來改善其運(yùn)動(dòng)能力和存活率，并有效保護(hù)其骨骼肌和肌原纖維的完整性。盡管如此，本文結(jié)果還顯示，運(yùn)動(dòng)鍛煉并不能完全逆轉(zhuǎn)高鹽膳食對果蠅壽命的損害，其主要機(jī)制與該組果蠅的氧化應(yīng)激和Salt基因表達(dá)未恢復(fù)到正常飲食果蠅水平有關(guān)，這說明高鹽膳食對壽命的危害大于運(yùn)動(dòng)的延長壽命效益。此外，在正常飲食的果蠅中，運(yùn)動(dòng)并不能明顯下調(diào)Salt基因表達(dá)，提示Salt基因可能不參與耐力運(yùn)動(dòng)對高鹽膳食果蠅影響的機(jī)制調(diào)節(jié)。

3.2 耐力運(yùn)動(dòng)對Salt基因過表達(dá)果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命的影響

果蠅Salt基因與人類SLC5A12基因?qū)偻椿颍幋a鈉-溶質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，果蠅Salt基因表達(dá)上調(diào)能使鈉-溶質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)增加，這將造成過多鈉離子被腸道吸收，果蠅血液、淋巴和細(xì)胞質(zhì)中鈉離子濃度增加，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞，因此，Salt基因過表達(dá)果蠅在正常飲食情況下壽命也會(huì)縮短［12，16］。關(guān)于人類SLC5A12基因是否與人體鹽耐受性有關(guān)，國內(nèi)外研究［21-23］仍較少。本文結(jié)果顯示，果蠅Salt基因過表達(dá)對其壽命的影響與既往研究結(jié)果類似，Salt基因過表達(dá)能縮短果蠅壽命。此外，本文還發(fā)現(xiàn)，果蠅Salt基因過表達(dá)能削弱其運(yùn)動(dòng)耐受性，這可能與Salt基因過表達(dá)果蠅的骨骼肌遭受損傷有關(guān)。與果蠅高鹽膳食結(jié)果類似，果蠅Salt基因過表達(dá)能顯著下調(diào)Foxo基因表達(dá)，減少SOD的活力，使毒性產(chǎn)物MDA和ROS增加。研究［6］表明，在果蠅Salt基因敲減的情況下，高鹽膳食不能顯著縮短果蠅的壽命。因此，推測果蠅Salt基因過表達(dá)導(dǎo)致其鹽耐受性降低，機(jī)體內(nèi)鈉離子代謝紊亂，鈉離子超載造成果蠅機(jī)體抗氧化能力降低，氧自由基攻擊骨骼肌致使運(yùn)動(dòng)能力減弱，同時(shí)，氧自由基也會(huì)攻擊其他組織和器官導(dǎo)致果蠅壽命縮短［24］。

研究［25］表明，耐力運(yùn)動(dòng)對哺乳動(dòng)物和果蠅的運(yùn)動(dòng)能力和壽命產(chǎn)生良好效應(yīng)，其機(jī)制與抗氧化能力增強(qiáng)密切相關(guān)，在不同的遺傳背景下，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能對運(yùn)動(dòng)能力和壽命造成不利影響。為進(jìn)一步證實(shí)抗氧化性是否為耐力運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)鹽耐受性的主要原因，本文利用UAS/arm-Gal4系統(tǒng)通過雜交使果蠅Salt基因遺傳性地全身過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耐力運(yùn)動(dòng)同樣對遺傳性Salt基因全身過表達(dá)果蠅的攀爬能力和壽命有明顯提升效果。與耐力運(yùn)動(dòng)對高鹽膳食果蠅的影響不同的是，Salt基因全身過表達(dá)果蠅在耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，Salt基因表達(dá)并未發(fā)生明顯改變，而抗氧化能力顯著增加。這一結(jié)果提示，耐力運(yùn)動(dòng)能改善Salt基因全身過表達(dá)對果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命造成的不利影響，其機(jī)制與果蠅機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)有關(guān)，與Salt基因及鈉-溶質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體活性無關(guān)。與果蠅不同的是，人類在運(yùn)動(dòng)過程中，通過汗腺的排泄，機(jī)體的鈉離子含量將減少，這能否改善高鹽膳食對人類的危害，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 Foxo過表達(dá)對高鹽膳食果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命的影響

為進(jìn)一步證實(shí)機(jī)體抗氧化能力是改善高鹽膳食對果蠅運(yùn)動(dòng)能力和壽命危害的重要因素，本文同樣利用UAS/arm-Gal4系統(tǒng)通過雜交使目標(biāo)基因Foxo成功地全身過表達(dá)。Foxo是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的凋亡、應(yīng)激、DNA損傷/修復(fù)及糖脂代謝調(diào)節(jié)中起著重要作用。Foxo亞家族具有高度保守的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)是蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）激酶的磷酸化靶位點(diǎn)，F(xiàn)oxo活性受翻譯后修飾（包括磷酸化和乙?；┱{(diào)節(jié)［26-27］。

研究［28］表明，F(xiàn)oxo對SOD轉(zhuǎn)錄合成有上游調(diào)節(jié)作用，而SOD是清除氧自由基的重要蛋白酶，因此，F(xiàn)oxo與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。研究［29-30］證實(shí)，果蠅Foxo過表達(dá)或激活能使其壽命顯著延長，本文結(jié)果與既往研究結(jié)果類似。此外，本文還發(fā)現(xiàn)，果蠅Foxo過表達(dá)能增強(qiáng)果蠅的快速攀爬能力，這可能與Foxo過表達(dá)使SOD活力增加，導(dǎo)致果蠅機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)、毒性產(chǎn)物MDA減少有關(guān)。在運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的大量氧自由基是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的重要原因，而Foxo過表達(dá)能提高機(jī)體（包括骨骼?。┑目寡趸芰?，這能減少氧化應(yīng)激對骨骼肌的損害，并使其運(yùn)動(dòng)能力得以增強(qiáng)［19-20］。

此外，本文結(jié)果還顯示，F(xiàn)oxo過表達(dá)能顯著減少高鹽膳食對果蠅的損害，如Foxo過表達(dá)能顯著延長高鹽膳食果蠅的壽命，增強(qiáng)其運(yùn)動(dòng)耐受性和抗氧化能力，減少自由基損傷，并能有效地下調(diào)高鹽膳食誘發(fā)的Salt基因過表達(dá)。已有研究［17-18］證實(shí)，高鹽膳食能增強(qiáng)機(jī)體氧化應(yīng)激，而遺傳性地增強(qiáng)果蠅抗氧化能力能增強(qiáng)其高鹽耐受性，這提示增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力是抵抗高鹽膳食對健康危害的重要手段之一。本文結(jié)果顯示，無論是Foxo過表達(dá)還是耐力運(yùn)動(dòng)，都無法使高鹽膳食果蠅的壽命、運(yùn)動(dòng)能力、抗氧化能力恢復(fù)到正常膳食果蠅水平，這可能與高鹽膳食可能還損害果蠅其他重要臟器和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)（如滲透壓平衡等）有關(guān)，但有待進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

Foxo/SOD通路活性增強(qiáng)和Salt基因表達(dá)下調(diào)是耐力運(yùn)動(dòng)后高鹽膳食果蠅的運(yùn)動(dòng)能力提升和壽命延長的重要分子機(jī)制；果蠅Salt基因過表達(dá)對Foxo/SOD通路活性有下游調(diào)節(jié)作用，并能降低運(yùn)動(dòng)能力和縮短生命周期；耐力運(yùn)動(dòng)能通過提高Foxo/SOD通路活性，減緩Salt基因過表達(dá)誘發(fā)的果蠅運(yùn)動(dòng)能力下降和壽命衰減。

作者貢獻(xiàn)聲明：

文登臺(tái)：提出論文主題，設(shè)計(jì)論文框架，撰寫論文，實(shí)驗(yàn)取材；

后文其：果蠅雜交及收集，核實(shí)數(shù)據(jù)；

郗增輝：果蠅運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，修改論文；

翟帥帥：審核、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。