營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)豹皮樟扦插苗葉片光合生理特性的影響

曾維軍，屈坤杰，李 鵬，萬 誠(chéng)，席培宇，王濟(jì)紅*

(1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2.上海市巖土地質(zhì)研究院有限公司，上海 200072)

豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.sinensis)是樟科、木姜子屬朝鮮木姜子的變種，常綠喬木，零星分布于貴州、四川、重慶、安徽、廣東和云南等亞熱帶地區(qū)，生長(zhǎng)于海拔900 m以下山地雜木林中。豹皮樟根、葉入藥，全年可采。其嫩葉是西南地區(qū)傳統(tǒng)茶飲老鷹茶的主要原料，具消暑解渴，消食祛脹，降血糖、降血脂等功效[1，2]。礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)對(duì)茶樹的生理生化影響顯著，其中氮、磷、鉀、鈣、鐵是大多數(shù)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素。如缺鉀的茶樹生物量、葉片鉀含量、葉綠素含量、葉片CO2同化速率、氣孔導(dǎo)度、水分利用率等都顯著下降，而胞間CO2濃度會(huì)顯著升高[3]；Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可緩解逆境脅迫對(duì)植物的傷害[4]；鎂是葉綠素的組成成分，葉綠素a和葉綠素b中都含有鎂，對(duì)植物的光合作用、碳水化合物的代謝和呼吸作用具有重要意義[5]。但豹皮樟作為老鷹茶的原料，其生理生化特性與眾多茶樹具有差異，其光合生理特性直接影響著葉片有機(jī)物的積累，不同營(yíng)養(yǎng)元素又參加了其生理代謝過程，所以研究營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)豹皮樟扦插苗葉片光合生理特性的影響具有重要意義，同時(shí)也可以為豹皮樟科學(xué)合理補(bǔ)充礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)達(dá)到提質(zhì)增效的效果提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)材料為貴州省生物研究所與貴州省湄潭縣恒源農(nóng)牧有限公司在貴州省湄潭縣茶產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)共同培育的豹皮樟3年生扦插苗，平均株高(25±2)cm、基徑粗(3±0.5)mm。用口徑×高為15 cm×20 cm塑料盆栽植，栽培基質(zhì)為蛭石，每盆裝基質(zhì)1.0 kg，定植1株。

將材料種植在貴州省湄潭縣興隆鎮(zhèn)丁家溝村試驗(yàn)大棚中，溫度為自然變溫，大棚遮蔭率為50.0%。材料種植地屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，夏季溫暖濕潤(rùn)，冬季干燥寒冷，年平均氣溫14.9 ℃，最冷月(1月)平均氣溫3.8 ℃，最熱月(7月)平均氣溫25.1 ℃，無霜期平均284 d，年日照時(shí)數(shù)1163 h，年總輻射量3488 MJ·m2。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液配方配制儲(chǔ)備液與營(yíng)養(yǎng)液。共設(shè)置7個(gè)處理：完全營(yíng)養(yǎng)液、缺N、缺P、缺K、缺Ca、缺Mg、缺Fe、CK(清水)；每種處理30株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。定植后30 d開始噴施處理，間隔7 d噴施1次，每次每株用量20 mL，連續(xù)噴施處理15次。定植后所有處理基質(zhì)相對(duì)含水量保持在30.0%左右，澆水需在噴施營(yíng)養(yǎng)液3 d日后進(jìn)行。

1.3 儀器設(shè)備

帶紅藍(lán)光源的Li-6400光合測(cè)定儀(LI-COR，美國(guó))、UV-1800SPC雙光束紫外分光光度計(jì)(Macy，中國(guó))、Primovert顯微鏡(ZEISS，德國(guó))、電鏡掃描、NX50冷凍切片機(jī)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))。

1.4 測(cè)定的方法

1.4.1 光合日變化的測(cè)定 6月5日，晴天天氣，從8∶00到18∶00每隔1 h選定相同營(yíng)養(yǎng)脅迫處理下3株豹皮樟扦插苗頂枝的1片成熟葉，使用Li-6400光合測(cè)定儀測(cè)量其凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、細(xì)胞間隙二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，同時(shí)記錄光合有效輻射(PAR)、周圍大氣二氧化碳濃度(Ca)、空氣溫度(T)及相對(duì)濕度(RH)。

1.4.2 光合作用氣體交換參數(shù)的測(cè)定 在Li-6400光合測(cè)定儀上安裝紅藍(lán)光源，以豹皮樟扦插苗的光響應(yīng)曲線的凈光合速率最大值對(duì)應(yīng)光強(qiáng)1000 μmol/(m2·s)為設(shè)定光強(qiáng)，選擇晴天9∶30～11∶30，使用CO2注入系統(tǒng)，穩(wěn)定CO2濃度在400 mol/(m2·s)；選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，隨機(jī)選取完全伸展、無病蟲害和無機(jī)械損傷葉片為對(duì)象，重復(fù)測(cè)定3株，每片葉重復(fù)記錄3個(gè)觀測(cè)值。系統(tǒng)自動(dòng)記錄Pn(凈光合速率)、Gs(氣孔導(dǎo)度)、Ci(細(xì)胞間CO2濃度)、Tr(蒸騰速率)。計(jì)算Ls(氣孔限制值)、WUE(葉片水分利用率)，Ls=1-Ci/Ca，WUE=Pn/Tr。

1.4.3 光合特性理化指標(biāo)的測(cè)定 葉綠素含量的測(cè)定采用丙酮法；過氧化物酶POD活力的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶CAT活力的測(cè)定采用碘量滴定法；超氧化物歧化酶SOD活力的測(cè)定采用氯化硝基四氮唑光化還原法。

1.4.4 葉片橫切面顯微觀察 使用NX50冷凍切片機(jī)對(duì)豹皮樟扦插苗葉片進(jìn)行切片。不同處理選取頂端成熟葉片橫切面制片，葉片橫切面使用Primovert顯微鏡進(jìn)行觀察，每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選5個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以200倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，選取10處測(cè)量每張片子的上表皮厚度(mm)、下表皮厚度(mm)，測(cè)量出柵欄組織和海綿組織的厚度(mm)、密度(每個(gè)視野中柵欄組織和海綿組織的個(gè)數(shù))。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，采用S-N-K法進(jìn)行方差檢驗(yàn)，用Graphpad Prism 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化參數(shù)比較

如表1所示，缺素處理下豹皮樟扦插苗葉片光合日變化曲線類型有改變，缺P處理的“光合午休時(shí)間”最長(zhǎng)，為4 h；缺K、缺Ca的最短，為1 h；缺Ca的日凈光合速率最大值和均值與其他處理相比較高，完全營(yíng)養(yǎng)下的較小；缺N的凈光合速率日變化變異系數(shù)最低，為14.55%，缺Ca的次之，為17.68%，完全營(yíng)養(yǎng)下凈光合速率日變化變異系數(shù)最高，為34.61%。

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用氣體交換參數(shù)差異分析

在不同營(yíng)養(yǎng)脅迫處理下，缺Ca的豹皮樟扦插苗葉片的凈光合速率均值為6.17 μmol/(m2·s)，顯著大于其他處理。缺N和缺K的葉片氣孔導(dǎo)度均值分別為0.084、0.099 mol/(m2·s)，顯著高于其他處理，此兩者間差異不顯著，但是缺K的氣孔導(dǎo)度測(cè)量參數(shù)離散程度較高；缺P和缺Mg的氣孔導(dǎo)度比其他處理顯著降低；但和完全營(yíng)養(yǎng)下的相比差異不顯著。CK、缺N和缺K的胞間CO2濃度差異不顯著，均顯著高于其他處理；缺P的胞間CO2濃度為112.56 μmol/mol，顯著低于其他處理。缺K和缺Ca的葉片的蒸騰速率相當(dāng)，均顯著高于其他處理，但缺K的蒸騰速率測(cè)量值參數(shù)離散度較大；缺P的和完全營(yíng)養(yǎng)下的蒸騰速率相當(dāng)，顯著低于其他處理。葉片的氣孔限制值以缺P的最高，缺K的最低。完全營(yíng)養(yǎng)和缺P下的葉片水分利用率相差不顯著，但顯著高于CK；缺N和缺K的葉片水分利用率相差不顯著，顯著低于CK(圖1)。

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用氣體交換參數(shù)的差異

2.3 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗的葉片面積、總?cè)~綠素含量差異分析

在各種缺素處理和完全營(yíng)養(yǎng)下的豹皮樟扦插苗的葉面積均顯著低于CK，其中缺K和缺Ca的葉面積分別為8.16、7.73 cm2，兩者差異不顯著，但均顯著低于其他處理；CK和缺K的葉片總?cè)~綠素含量最高，完全營(yíng)養(yǎng)和缺Mg的最低(圖2)。

圖2 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片面積、總?cè)~綠素含量的差異

2.4 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結(jié)構(gòu)差異分析

在完全營(yíng)養(yǎng)、缺P、缺Ca、缺Mg處理下的豹皮樟扦插苗的葉片上表皮厚度都顯著低于CK，其中缺Mg的最低；缺N和缺Fe的葉片下表皮厚度顯著高于CK；CK的柵欄組織厚度最低，缺Ca的葉片柵欄組織厚度顯著高于其他處理；缺N時(shí)，葉片海綿組織厚度最高，CK和缺Ca的海綿組織厚度差異不顯著，但都顯著低于其他處理；各營(yíng)養(yǎng)脅迫處理下的豹皮樟扦插苗葉片柵欄組織密度差異不顯著，海綿組織密度差異顯著，其中缺N的海綿組織密度顯著高于CK及其他處理(圖3、圖4)。

A～H分別是CK、完全營(yíng)養(yǎng)液、缺N、缺P、缺K、缺Ca、缺Mg、缺Fe下豹皮樟扦插苗葉片橫切面組織顯微結(jié)構(gòu)。

圖4 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結(jié)構(gòu)量化參數(shù)

2.5 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用相關(guān)酶類活性分析

如圖5所示，缺N的豹皮樟扦插苗葉片POD活性顯著高于其他處理，CK和缺Mg的POD活性顯著降低；缺素處理下的葉片CAT活性均顯著低于完全營(yíng)養(yǎng)和CK，其中CK顯著低于完全營(yíng)養(yǎng)下的；完全營(yíng)養(yǎng)和缺N下的PPO活性顯著增高，缺Ca的顯著降低。

圖5 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用相關(guān)酶類活性的差異性分析

3 討論與結(jié)論

在缺氮條件下，葉片CO2同化速率、氣孔導(dǎo)度都顯著下降，胞間CO2濃度顯著增加，但是缺氮后的表現(xiàn)在不同品種間存在一定的差異[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮條件下豹皮樟扦插苗葉片的氣孔導(dǎo)度顯著高于對(duì)照，胞間CO2濃度則與CK無顯著差異，缺磷和缺鎂的葉片氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度顯著低于對(duì)照，缺氮下的氣孔導(dǎo)度、過氧化物酶及多酚氧化酶活性顯著高于對(duì)照。光合植物中多酚氧化酶定位于葉綠體類囊體膜上，由此推測(cè)多酚氧化酶可能與豹皮樟的光合作用有關(guān)，多酚氧化酶可能對(duì)其光合作用進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，并參與構(gòu)成電子傳遞鏈和能量轉(zhuǎn)換。

缺磷茶樹葉片的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性降低[6]，其中過氧化氫酶活性降低和本試驗(yàn)豹皮樟扦插苗葉片過氧化氫酶活性顯著低于對(duì)照的結(jié)果相似；同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，缺磷下的過氧化物酶和多酚氧化酶活性是顯著高于對(duì)照的，這兩個(gè)酶反映植物的抗性，說明缺磷下豹皮樟?xí)ㄟ^自身生理調(diào)節(jié)來提高抗逆性。

在缺鉀條件下茶樹的葉綠素含量、葉片CO2同化速率、氣孔導(dǎo)度、水分利用率等都顯著下降，而胞間CO2濃度會(huì)顯著升高[3]。缺鉀葉片還通過增加熱耗散以保護(hù)葉片在強(qiáng)光下免遭光氧化傷害[7]。但是在本研究中，缺鉀的豹皮樟扦插苗的葉綠素總量、氣孔導(dǎo)度與對(duì)照相比并沒有顯著下降，凈光合速率與胞間CO2濃度無顯著變化；缺鉀下豹皮樟扦插苗葉面積、葉片上表皮厚度下降，說明缺鉀顯著影響著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育；葉片中過氧化氫酶、多酚氧化酶活性下降，說明抗逆性減弱；缺鉀下豹皮樟葉片蒸騰速率的增加可以增加熱耗散以保護(hù)葉片在強(qiáng)光下免遭光氧化傷害，這和部分學(xué)者的研究結(jié)果相似。

鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在維持細(xì)胞膜磷脂及膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性中起重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)缺鈣的豹皮樟的凈光合速率最大值、蒸騰速率、柵欄組織厚度均顯著高于對(duì)照。在自然生長(zhǎng)條件下，Rubisco的活化、RuBP的再生是完整的葉片以較佳狀態(tài)進(jìn)行光合作用的兩個(gè)重要代謝步驟，主要發(fā)生在葉片的柵欄組織和海綿組織細(xì)胞內(nèi)[9]，所以缺鈣時(shí)豹皮樟扦插苗一是通過增加葉片柵欄組織的厚度，增加光合生化反應(yīng)場(chǎng)所來促進(jìn)光合生理代謝；二是提高葉片的蒸騰速率來應(yīng)對(duì)環(huán)境改變。

鎂是葉綠素環(huán)形結(jié)構(gòu)的主要組成元素，是磷酸轉(zhuǎn)移許多酶必需的元素。在本研究中，缺鎂沒有顯著改變豹皮樟的凈光合速率，但是葉綠素總量，以及過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶活性均低于對(duì)照，說明豹皮樟缺鎂，影響葉綠素合成及磷酸轉(zhuǎn)移，從而會(huì)影響其光合作用和呼吸作用。

鐵和細(xì)胞色素合成有關(guān)，缺鐵會(huì)導(dǎo)致植物葉片缺綠現(xiàn)象，從而降低光合作用[10]。在本研究中，缺鐵下的豹皮樟光合日變化中凈光合速率均值較低，但凈光合速率和葉綠素總量與對(duì)照差異不顯著。

總之，氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)豹皮樟扦插苗的光合日變化、氣體交換參數(shù)、葉面積、葉綠素、葉片組織結(jié)構(gòu)及抗逆性酶類都有影響，但各不相同，從而改變著豹皮樟扦插苗的光合生理特性。