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    間接免疫熒光法檢測抗核抗體室內(nèi)質(zhì)控品制備和性能驗證

    2021-10-19 09:23:22高雪丹蘇真珍黃卓春胡靜王麗楊濱
    關鍵詞:弱陽性核型滴度

    高雪丹,蘇真珍,黃卓春,胡靜,王麗,楊濱

    自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用下由機體免疫系統(tǒng)對自身器官、組織、細胞等抗原成分產(chǎn)生免疫反應使其受到攻擊,從而造成機體器官或組織免疫損傷及功能障礙的一類疾病[1-2]。近年來,自身免疫性疾病的發(fā)病率逐漸上升[3],該類疾病發(fā)病隱匿,但在疾病早期就可檢測到患者體內(nèi)的自身抗體[4],且自身抗體的檢測對自身免疫性疾病的輔助診斷、分層分型、病情判斷及預后判斷也有重要意義[5],因此準確的自身抗體檢測尤為重要??购丝贵w(antinuclear antibodies,ANA)是最常見的一類自身抗體,主要用于預測、發(fā)現(xiàn)并及早干預系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等ANA相關自身免疫性疾病[6]。

    目前國內(nèi)已有較多實驗室開展了ANA的檢測,檢測方法主要為間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IIF)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等,其中IIF法為國際國內(nèi)共識推薦的篩查自身免疫性疾病的金標準方法[7-9]。但該方法存在操作繁瑣、自動化程度低、需人工肉眼判讀結果等眾多影響因素,目前國內(nèi)外均缺乏權威機構提供可量值溯源的ANA檢測商品化室內(nèi)質(zhì)控品,無法對IIF法檢測ANA全過程進行質(zhì)量監(jiān)控,難以保證實驗室檢測結果的準確性,導致實驗室檢測難以達到規(guī)范化和同質(zhì)化。目前有些廠商試劑盒雖有配套的ANA質(zhì)控品,但往往并非血清基質(zhì),基質(zhì)效應不明確,同時無法覆蓋從樣本稀釋開始的整個檢測過程。國內(nèi)部分實驗室雖有自制抗核抗體質(zhì)控,但其制備流程和性能驗證暫無可供借鑒的規(guī)范化操作程序或共識。為了有效監(jiān)測并保證實驗室IIF ANA檢測的質(zhì)量,本實驗室采用ANA陽性患者血清樣本制備IIF法檢測ANA的室內(nèi)質(zhì)控品,并對其進行性能驗證,同時應用全自動熒光圖像采集儀(熒光判讀儀)采集質(zhì)控品熒光圖像并判讀熒光強度值作為驗證指標,以建立適用于ANA臨床檢測的室內(nèi)質(zhì)控品自制和性能驗證規(guī)范化程序。

    1 材料與方法

    1.1 儀器和試劑

    1.2 方法

    1.2.1 血清樣本來源

    (1)收集1例ANA強熒光強度(滴度1∶3 200~1∶10 000,均質(zhì)型或顆粒型)和數(shù)例無熒光反應(陰性)患者血清,由于本室已有數(shù)據(jù)(未發(fā)表)說明血清中抗dsDNA抗體檢測具有一定不穩(wěn)定性,因此選取的強陽性樣本需排除dsDNA抗體相關ANA高滴度陽性。所選血清均為外觀無溶血、無脂血、無黃疸及細菌污染的血清,并均由羅氏Cobas e801化學發(fā)光儀檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體和梅毒螺旋體抗體為陰性。

    (2)ANA熒光強度及核型判定以肉眼熒光顯微鏡下以及熒光判讀儀同時判定為滴度1∶3 200~1∶10 000,均質(zhì)型或顆粒型單一核型為所需陽性樣本(本實驗以均質(zhì)型為例),肉眼及判讀儀同時判定為熒光陰性為所需陰性樣本。

    1.2.2 室內(nèi)質(zhì)控品制備

    (1)弱陽性質(zhì)控品:準確量取2 mL強熒光強度血清與58 mL陰性血清以1∶30(從1∶3 200~1∶10 000稀釋至目標滴度1∶100~1∶320)比例稀釋陽性血清樣本;陰性質(zhì)控品:量取60 mL陰性血清混合。

    (2)勻速攪拌5 min,而后將混合的血清置于56 ℃ 30 min條件下滅活,再以3 000 r/min離心15 min去除沉淀[10]。

    (3)分裝和保存質(zhì)控品:弱陽性質(zhì)控品分別以P1、P2、……、P60連續(xù)編號以帶蓋EP管(容量為1.5 mL)保存;陰性質(zhì)控品分別以N1、N2、……、N60連續(xù)編號以帶蓋EP管(容量為1.5 mL),勻速攪拌同時,將弱陽性和陰性混合血清分別分裝至相應標示的EP管中,1 mL/支,共60支。分裝完成后裝入指定密封袋并清楚標示名稱、制備人、制備時間等相關信息后放入-20 ℃冰箱凍存。剩余血清嚴格按照生物危險品進行廢棄處理。

    1.2.3 自制質(zhì)控品性能驗證

    (1)均勻性驗證及質(zhì)控品賦值:在凍存分裝好的質(zhì)控品前選取編號P1、P11、P21、P31、P41、P51共6支弱陽性質(zhì)控與N1、N11、……、N51共6支陰性質(zhì)控品同時在IF Sprinter XL上按臨床樣本檢測流程進行檢測(起始稀釋倍數(shù)1∶100);弱陽性和陰性質(zhì)控品的判定結果均值為質(zhì)控品賦值,因半定量檢測無法準確計算均值,此處以超過半數(shù)的判定結果為質(zhì)控品靶值。

    (2)穩(wěn)定性驗證:質(zhì)控品制備好后即隨機選取弱陽性及陰性質(zhì)控品各1管,復溶后保存于2~8 ℃冰箱,每日隨患者樣本同批進行質(zhì)控品檢測,連續(xù)測定10 d,以驗證質(zhì)控品的短期穩(wěn)定性;每隔30 d隨機取用-20 ℃凍存的(弱)陽性及陰性質(zhì)控品各一支,隨當日患者樣本同批進行質(zhì)控品檢測,持續(xù)12個月,以驗證長期穩(wěn)定性。

    (3)采用自制質(zhì)控品驗證儀器重復性和儀器間一致性:隨機選取陰陽性質(zhì)控品各一管,在一臺IF Sprinter XL儀器的同一批次檢測上樣順序的前中后進行檢測以驗證批內(nèi)重復性;同時在兩臺IF Sprinter XL儀器上每日隨樣本每批進行ANA檢測,連續(xù)10 d,以驗證批間重復性及儀器可比性。

    所有性能驗證結果均同時由雙人閱片和熒光判讀儀共同判讀結果,在控的判斷標準為弱陽性質(zhì)控品同一核型質(zhì)控品間及同一質(zhì)控品多次檢測結果間滴度梯度≤1個稀釋度(滴度1∶100~1∶320)且熒光核型一致,陰性質(zhì)控品結果均為陰性。

    2 結果

    2.1 均勻性驗證及質(zhì)控品賦值

    所有弱陽性質(zhì)控品在1∶100稀釋倍數(shù)下進行檢測并通過人工和熒光判讀儀判讀,均可判讀為1∶100(4/6)或1∶320(2/6)均質(zhì)型,所有陰性質(zhì)控品均判讀為陰性;熒光判讀儀判讀弱陽性質(zhì)控品熒光強度的均值和變異系數(shù)(CV)分別為93.67和5.83%,陰性質(zhì)控品均未顯示熒光強度。本批次制備弱陽性質(zhì)控品靶值為1∶100,陰性質(zhì)控品靶值為陰性(表1)。

    表1 ANA自制質(zhì)控品均勻性驗證Table 1 Uniformity verification of ANA home-made quality control product

    2.2 穩(wěn)定性驗證

    隨機選取的弱陽性質(zhì)控品在1∶100稀釋比例下檢測結果通過人工和熒光判讀儀判讀結果均在1∶100~1∶320之間,核型均為均質(zhì)型,所有陰性質(zhì)控品均判讀為陰性;熒光判讀儀判讀弱陽性質(zhì)控品短期(10 d)、長期(12月)及總體熒光強度值的均值和變異系數(shù)(CV)分別為85.5和9.90%,88.15和8.49%及87和9.24%,陰性均未顯示熒光強度(表2)。

    表2 ANA質(zhì)控品短期及長期穩(wěn)定性驗證Table 2 Short-term and long-term stability verification of ANA quality control products

    2.3 采用自制質(zhì)控品驗證儀器批間檢測重復性和儀器間一致性

    隨機選取的弱陽性質(zhì)控品在同批測試前中后順序熒光滴度均為1∶320,熒光強度較穩(wěn)定(表3);批間檢測重復性驗證和儀器可比性中弱陽性質(zhì)控品熒光滴度均在1∶100~1∶320范圍內(nèi),且核型一致,陰性質(zhì)控品均為陰性。在A臺第1批、A臺第2批和B臺第1批的熒光強度均值分別為83.50、85.40和83.20,CV分別為6.76%、6.27%和7.99%,總體均值和CV分別為84.00和7.28%,當日不同批次弱陽性質(zhì)控品熒光強度CV有80%的情況小于10%,陰性質(zhì)控品均未顯示熒光強度值(表4)。

    表3 ANA質(zhì)控品批內(nèi)重復性驗證Table 3 In-batch repeatability verification of ANA quality control products

    表4 ANA質(zhì)控品批間檢測重復性及儀器可比性驗證Table 4 Test repeatability and instrument comparability verification of ANA quality control products between batches

    3 討論

    ANA是目前臨床應用最廣泛、最經(jīng)典的一類自身抗體,采用IIF檢測ANA也是國際國內(nèi)共識所推薦的篩查自身免疫性疾病的金標準方法[7-9]。但IIF檢測具有手工操作步驟多、熒光易淬滅、對檢測人員水平要求高、結果判定主觀性強等影響因素容易導致檢測結果不準確和結果判讀的不一致。因此,對IIF檢測ANA的室內(nèi)質(zhì)量控制是保證ANA檢測質(zhì)量的重要措施[11],但目前,國內(nèi)基于血清基質(zhì)的ANA商品化質(zhì)控品尚未普及。國內(nèi)外指南和文獻中均有提到,在保證最小基質(zhì)效應、足夠的穩(wěn)定性、較小的瓶間差的前提下,可使用源自臨床標本的自制質(zhì)控,且選擇接近臨界點或醫(yī)學決定水平附近濃度的陽性或陰性質(zhì)控品更容易檢測出實驗過程中的錯誤[9,12-13]。采用臨床樣本自制質(zhì)控有方便獲得、經(jīng)濟性強、無基質(zhì)效應等較多優(yōu)點[10],但對于用IIF檢測ANA的實驗室自制質(zhì)控品尚缺乏規(guī)范有效的制備流程和評價體系。因此,為更有效的保證ANA實驗室檢測結果的一致性和準確性,本實驗室構建用于IIF檢測ANA的自制弱陽性質(zhì)控品制備和評價程序以進行室內(nèi)質(zhì)控。

    目前國內(nèi)大多數(shù)實驗室仍采用傳統(tǒng)熒光顯微鏡判讀ANA結果,存在較多主觀因素,如人員之間不一致、受已知滴度結果誘導等主觀因素,同時肉眼判讀也無法靈敏準確地判斷出檢測過程的系統(tǒng)性誤差,難以保證檢測結果的穩(wěn)定性。且目前國內(nèi)外公認的ANA滴度判定在上下一個滴度均可接受[11,16],導致人工判讀結果存在較大的異質(zhì)性,本實驗室首次采用全自動熒光判讀儀對熒光片進行判讀,并納入其判讀的熒光強度值,作為定量結果輔助衡量自制質(zhì)控品的檢測結果的穩(wěn)定性。實驗室定量結果能力驗證和質(zhì)量評價中需達到的性能要求在不低于國家標準和行業(yè)標準的基礎上需按項目及實驗室條件進行設置[17],而目前國內(nèi)行業(yè)標準中尚無針對自身抗體檢測項目的允許不精密度(變異系數(shù))[14,18],且國內(nèi)尚無實驗室以ANA熒光強度值作為質(zhì)量控制指標。本研究參考室間質(zhì)評標準(1/3總允許誤差),以10%的CV作為ANA質(zhì)控品熒光強度的質(zhì)量控制標準。本實驗室自制質(zhì)控品進行性能驗證的熒光強度值結果顯示,該批次質(zhì)控品在均勻性和穩(wěn)定性上的熒光強度值變異系數(shù)基本在10%范圍內(nèi)。一方面說明本實驗室自制ANA的質(zhì)量基本符合臨床需求,另一方面也說明自動判讀熒光強度值在ANA結果判讀中有一定的應用價值。且質(zhì)控品的熒光強度值也可極大的幫助檢驗人員對臨床樣本熒光滴度的結果判讀進行調(diào)整。已有研究顯示具有采集圖像并計算定量測定值功能的自動化熒光判讀系統(tǒng)與ANA最終滴度存在明顯相關性[19-20],但其價值仍有待進一步研究。

    本研究自制質(zhì)控品在性能驗證方面表現(xiàn)良好,但仍存在一些局限性。ANA是一組最常見的自身抗體,公認的以Hep-2細胞為基質(zhì)的ANA靶抗原已有100~150種之多[8],其對應的ANA在IIF檢測中有不同的表現(xiàn)核型,同一種核型也可對應多種自身抗體。在ANA質(zhì)控品自制過程中,幾乎無法實現(xiàn)制備可覆蓋大多數(shù)ANA種類的質(zhì)控品,受成本限制也難以制備和同時使用多種單一核型或復合核型的質(zhì)控品,故本研究選取臨床上相對常見,且與最常見的自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關性較高的熒光核型均質(zhì)型作為質(zhì)控核型。該核型質(zhì)控品基本可實現(xiàn)全操作流程的監(jiān)控,可識別檢測過程中可能出現(xiàn)的錯誤,但無法驗證其他核型可能受到的未知影響。因此,對于不同核型的檢測是否需要不同的質(zhì)控品以保證質(zhì)量仍需進一步驗證。另外,因作為臨床每日常規(guī)使用質(zhì)控品,本研究選取的臨床樣本需進行滅活后再使用,本研究未進行詳細的滅活前后的一致性分析,因此對于ANA在滅活條件下是否會有抗體效價和結構的改變?nèi)杂写乱徊接懻摗?/p>

    綜上,經(jīng)采用人工判讀和熒光判讀儀判讀的熒光強度值共同驗證的本實驗室自制的抗核抗體質(zhì)控品具有較好的均一性和穩(wěn)定性,可滿足臨床需求,保證抗核抗體檢測質(zhì)量,并可為其他實驗室制備和驗證抗核抗體質(zhì)控品提供參考。

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