小鼠碳酸二甲酯亞急性吸入毒性研究

喬千里 付志華 蔡功玉 葉榮軍 康 凡 王學文 雷乾坤 陳燁韜 賀海波 許登清

(1. 中國石油化工股份有限公司 湖北化肥分公司， 湖北 宜昌 443200； 2. 三峽大學 生物與制藥學院, 湖北 宜昌 443002)

乙二醇(ethylene glycol，EG)是一種廣泛應用于精細化工、醫(yī)藥等領域的重要原料[1]。隨著EG需求的日益增加，導致了EG產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展[2,3]。但是合成EG過程中會產(chǎn)生大量的碳酸二甲酯、氮氧化物等副產(chǎn)物，且它們多以氣溶膠的形式存在于工作場所的空氣中。自EG工業(yè)化生產(chǎn)以來，陸續(xù)有職業(yè)性急性中毒事故的報道[4,5]。近年來，職業(yè)性碳酸二甲酯亞急性中毒所致器官損傷成為關注焦點，但其毒性機制尚未完全闡明。碳酸二甲酯中毒主要以血液凈化聯(lián)合抗氧化應激、營養(yǎng)支持等對癥治療來減輕器官損傷。由于EG合成過程中的副產(chǎn)物碳酸二甲酯多以氣溶膠形式存在于廠區(qū)的空氣中，故迫切需要了解碳酸二甲酯對接觸者可能造成的傷害，廠區(qū)空氣中的容許濃度和職業(yè)接觸限值標準，降低廠區(qū)中此類物質(zhì)的方法等。在此基礎上建立一套切實有效的防止碳酸二甲酯傷害的安全防護措施，以確保EG一線生產(chǎn)職工的生命安全。據(jù)此，本文對碳酸二甲酯小鼠亞急性吸入的毒性作用和靶器官進行研究，以便為EG生產(chǎn)過程中的職業(yè)防護提供指導。

1 材料與方法

1.1 藥物

碳酸二甲酯由中國石油化工股份有限公司湖北化肥分公司提供，批號：20191027。

1.2 動物

SPF級雌雄各半的昆明小鼠(18～22 g)由三峽大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2017-0061，試驗編號為2020037。實驗小鼠飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)中，待適應環(huán)境1周后進行毒性實驗。實驗研究按照《化學品毒性鑒定技術規(guī)范》(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2005]272號)進行操作和評價，并被三峽大學倫理委員會批準和在其指導下進行。

1.3 試劑

血常規(guī)試劑購自拜耳醫(yī)藥。肌鈣蛋白I(cTnI)購自南京建成，批號為：20200825。生化試劑：肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和血糖(glucose，GLU)、總膽固醇(cholesterol，CHOL)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、總蛋白(total protein，TP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CREA)，購自北京利德曼，批號分別為：20200821、20200819、20200823、20200820、20200825、20200824、20200819、20200817、20200813、20200815、20200821。

1.4 儀器

電子體重秤(上海力衡)；電子天平(梅特勒-托利多)；生理記錄儀(美國Biopac)；離心機(德國Eppendorf)；血細胞分析儀(美國雅培)；生化分析儀(德國Siemens)；酶標儀(瑞士Tecan)；顯微鏡(日本Nikcon)；切片機(奧地利萊卡)；脫水機、圖像分析系統(tǒng)(德國Leica)。

1.5 方法

1.5.1 預實驗

20只小鼠按照1∶0.8組間劑量比值隨機分成4組，放入吸入染毒裝置內(nèi)(體積為97.5 L)吸入染毒。找出全部死亡的最小劑量(minimum dose for all deaths，Dm)及最大全不死劑量(maximum undead dose，Dn)。

1.5.2 正式實驗

預實驗測出碳酸二甲酯小鼠吸入染毒Dn為89.681 5 g，Dm為223.983 0 g，按照黃偉等[6]介紹的方法計算得組間r為0.80。實驗除正常組外，染毒小鼠分設5個劑量組：碳酸二甲酯223.983 0 g劑量組、碳酸二甲酯179.186 4 g劑量組、碳酸二甲酯143.349 1 g劑量組、碳酸二甲酯114.6793 g劑量組和碳酸二甲酯91.743 4 g劑量組，每組20只，雌雄各半。實驗動物給藥前禁食12 h，不禁水。實驗時依次將各組小鼠置于吸入染毒裝置內(nèi)(體積為97.5 L)，按照分組每次稱取相應劑量的碳酸二甲酯晶體放入陶瓷蒸發(fā)皿內(nèi)，關上染毒裝置柜門；然后開啟電磁加熱器電源加熱熔化、沸騰至完全揮發(fā)，然后依次開啟循環(huán)風機、O2檢測探頭、溫度監(jiān)測探頭，并實時監(jiān)測染毒柜內(nèi)O2濃度，通過鼓風機和抽風機，以保持染毒裝置內(nèi)所需的O2濃度。持續(xù)染毒2 h后將動物移至實驗動物中心觀察室內(nèi)，觀察小鼠一般狀況。實驗結束后，計算碳酸二甲酯的半數(shù)致死量(median lethal dose, LD50)及置信區(qū)間。

1.5.3 一般狀況觀察

觀察動物的中毒表現(xiàn)、死亡數(shù)及死亡時間，進行心電圖(electrocardiogram，ECG)檢測、依次取血、腦、肺、心、肝、脾、胃、腎、大小腸、子宮、卵巢、睪丸等組織，觀察上述臟器組織學病理變化。

1.5.4 ECG檢測

小鼠吸入染毒碳酸二甲酯2 h后，記錄實驗小鼠ECG指標變化。

1.5.5 血液學指標檢測

小鼠染毒7 d后，取血檢測白細胞(white blood cells，WBC)、紅細胞(red blood cells，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板(platelets，PLT)、中性粒細胞(neutrophils，NEU)、淋巴細胞(lymphocytes，LYM)、嗜酸性粒細胞(eosinophagocytes，EOS)、嗜堿性粒細胞(basophilic granulocytes，BASO)、單核細胞(monocytes，MONO)。

1.5.6 血液生化指標檢測

分離血清，進行心肌cTnI(膠乳增強免疫比濁法檢測)、CK-MB(免疫抑制法檢測)、LDH(比色法檢測)、AST(比色法檢測)、ALT(賴氏法檢測)活性和TBIL(化學氧化法檢測)、TP(比色法檢測)、ALP(比色法檢測)、CHOL(TCH酶法)、BUN(比色法檢測)、CREA(肌氨酸氧化酶法)、GLU含量檢測。

1.5.7 組織病理學HE染色

完成實驗小鼠取血后，分別摘取腦、肺、心、肝、脾、胃、腎、大小腸、子宮、卵巢、睪丸等組織，稱量上述臟器質(zhì)量，計算臟器質(zhì)量指數(shù)；然后觀察上述臟器解剖學及鏡下病理學變化。對出現(xiàn)病理學損傷的器官，每張組織切片鏡下觀察6個視野，對組織損傷的病變程度進行評分。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，以單因素方差分析進行多組間差異的比較，以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 碳酸二甲酯吸入染毒后小鼠一般情況

吸入給藥后，碳酸二甲酯223.983 0 g劑量組可觀察到小鼠出現(xiàn)痙攣、煩躁不安等中毒反應，并在2 h內(nèi)全部死亡；179.186 4 g劑量組和143.349 1 g劑量組吸入給藥后也出現(xiàn)抽搐、煩躁不安等中毒反應，并在給藥2 h后各死亡1只；吸入給藥2 h內(nèi)114.679 3 g劑量組可見上述中毒反應，但未出現(xiàn)小鼠死亡。給藥劑量越大，死亡潛伏期越短，中毒癥狀越明顯。未死亡小鼠也出現(xiàn)上述中毒反應，約1 h后恢復自主活動。用寇氏法計算得小鼠吸入染毒碳酸二甲酯的LD50為11.117 9×10-4g/cm3，95% CI為8.267 1×10-4～14.949 3×10-4g/cm3(見表1)。

表1 碳酸二甲酯吸入染毒后小鼠的情況觀察(n=20)

2.2 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠ECG的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯吸入染毒2 h后，小鼠ECG出現(xiàn)QRS波增寬、R-R間期延長和J點上移(均P<0.05或P<0.01)；碳酸二甲酯吸入染毒組小鼠心率相比正常組小鼠加快(均P<0.05或P<0.01)。實驗結果表明，碳酸二甲酯吸入染毒早期可出現(xiàn)明顯的ECG異常，而且隨著碳酸二甲酯吸入染毒劑量增加ECG異常更為明顯(見表2)。

表2 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠ECG的影響

2.3 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠心肌酶活性的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯組小鼠血液中cTnI含量和LDH、CK-MB活性明顯升高(均P<0.05或P<0.01)(見表3)。

表3 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液cTnI含量和LDH、CK-MB活性的影響

2.4 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液學指標的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯組小鼠血液中RBC、PLT、NEU和HGB明顯降低，而EOS、LYM、BASO、WBC、MONO明顯升高(均P<0.05或P<0.01)。實驗結果表明，碳酸二甲酯對實驗小鼠血液學指標有明顯的不良影響，而且隨著吸入染毒劑量增加血液學指標異常更為嚴重(見表4)。

表4 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液學指標的影響

2.5 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液生化指標的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯組小鼠血液中AST、ALT活性和BUN、TBIL、ALP、TP、CREA含量明顯升高(均P<0.05或P<0.01)；而CHOL、GLU含量無明顯改變(均P>0.05)。實驗結果表明，碳酸二甲酯對實驗小鼠血液生化指標有明顯的不良影響，而且隨著吸入染毒劑量增加，血液生化指標異常更為嚴重(見表5)。

表5 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液中生化指標的影響

2.6 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠臟器質(zhì)量系數(shù)的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯染毒組小鼠心、肺、肝、腎的臟器質(zhì)量系數(shù)明顯升高(均P<0.05或P<0.01)(見表6)。

表6 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠臟器質(zhì)量系數(shù)的影響

2.7 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肺組織形態(tài)學的影響

光鏡下可見正常組小鼠肺泡上皮結構完整，肺泡形態(tài)均勻、纖毛排列整齊；碳酸二甲酯吸入染毒后可見小鼠肺泡和肺泡隔中大量炎性細胞浸潤、肺泡隔增厚，毛細血管充血水腫(見圖1)。根據(jù)肺損傷病理評分標準[7]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肺組織損傷病理學評分分別為1.36±0.15、1.57±0.18、1.89±0.21、2.25±0.54和3.59±0.78分，明顯高于正常組0.34±0.09分(均P<0.01)。實驗結果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的肺損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖1 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肺組織形態(tài)學的影響

2.8 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠心臟組織形態(tài)學的影響

光鏡下可見正常組小鼠心肌細胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊、結構清晰。碳酸二甲酯吸入染毒后可見心肌細胞凋亡壞死、心肌纖維排列紊亂、胞核破碎溶解，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖2)。根據(jù)心肌損傷病理評分標準[8]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠的心肌組織損傷病理學評分分別為0.64±0.09、1.03±0.13、1.14±0.23、1.29±0.27和1.48±0.21分，明顯高于正常組0.00±0.00分(均P<0.01)。實驗結果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的心肌損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖2 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠心肌組織形態(tài)學的影響

2.9 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肝組織形態(tài)學的影響

光鏡下可見正常組小鼠肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列、肝血竇結構規(guī)整、胞核清晰完整；碳酸二甲酯吸入染毒后可見肝細胞排列紊亂、呈片狀壞死、胞核破碎溶解，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖3)。根據(jù)肝臟損傷病理評分標準[9]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肝組織損傷病理學評分分別為0.95±0.11、1.28±0.10、1.37±0.18、1.59±0.31和1.83±0.34分，明顯高于正常組0.00±0.00分，(均P<0.01)。實驗結果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的肝臟損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖3 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肝組織形態(tài)學的影響

2.10 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠小腸組織形態(tài)學的影響

光學顯微鏡下可見正常組小鼠腸上皮細胞結構完整、細胞間連接緊密、杯狀細胞及腺體豐富；碳酸二甲酯吸入染毒后可見上皮細胞充血水腫、排列雜亂，杯狀細胞及腺體減少，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖4)。根據(jù)小腸損傷病理評分標準[10]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠小腸組織損傷病理學評分分別為0.70±0.11、0.81±0.13、0.94±0.17、1.07±0.19和1.28±0.21分，明顯高于正常組0.11±0.03分(均P<0.01)。實驗結果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的小腸損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.7434 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖4 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠小腸組織形態(tài)學的影響

2.11 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠腎臟組織形態(tài)學的影響

光鏡下可見正常組小鼠腎小球結構完整，腎小管上皮細胞排列整齊、規(guī)則。碳酸二甲酯吸入染毒后可見腎小管上皮細胞排列紊亂、呈片狀壞死、腎小球結構紊亂，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖5)。根據(jù)腎損傷病理評分標準[11]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠腎組織損傷病理學評分分別為1.15±0.13、1.37±0.18、1.66±0.19、2.05±0.35和3.44±0.41分，明顯高于正常組0.00±0.00分(均P<0.01)。實驗結果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的腎損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖5 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠腎臟組織形態(tài)學的影響

2.12 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠其他臟器組織形態(tài)學的影響

病理組織學檢測結果表明，與正常組比較，碳酸二甲酯吸入染毒后，小鼠腦、胃、脾、腎上腺、睪丸、卵巢肉眼及鏡檢均無病理性改變。

3 討論

EG工業(yè)化生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物碳酸二甲酯對人體刺激性主要體現(xiàn)在眼結膜、呼吸道、消化道、皮膚，而其他器官傷害則報道不一[12]。由于目前尚缺乏規(guī)范的安全防護措施，職業(yè)性急性碳酸二甲酯中毒傷害時有發(fā)生[13-15]。因此，迫切需要了解碳酸二甲酯在廠區(qū)空氣中的容許濃度和職業(yè)接觸限值標準、對一線生產(chǎn)職工的毒性作用和作用的靶器官等，在此基礎上建立切實有效的安全防護措施。

眾所周知，CK-MB和cTnI常作為臨床診斷心肌損傷的重要標志物[16]。正常情況下，血液中CK-MB和cTnI活性較低；當心肌細胞遭受到物理、化學或生物性損傷時，胞漿內(nèi)CK-MB和cTnI會釋放入血液，使得血液中CK-MB和cTnI水平異常升高[17,18]。此外，當心肌預后不好時，血液中CK-MB和cTnI也會明顯升高。因此，分析血液中CK-MB和cTnI水平可判斷心肌損傷程度，評價藥物的治療效果[19,20]。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠吸入染毒后血液中CK-MB和cTnI水平明顯升高，此結果與ECG異常變化和心臟臟器系數(shù)升高，心肌凋亡壞死、心肌纖維排列紊亂、胞核破碎溶解的形態(tài)學損傷結果相一致。

ALT和AST是評估肝細胞損傷較為特異的指標之一[21]。當肝臟受到化學性等損傷時，肝細胞膜的通透性明顯增加，原來存在于肝細胞胞漿內(nèi)的ALT和AST迅速釋放入血液，導致血液中ALT和AST水平明顯升高[22,23]。此外，血液中的ALP、LDH在肝細胞受損時也會明顯升高[24,25]。本研究結果顯示，小鼠染毒后肝臟臟器系數(shù)，血液中ALT、AST、LDH、ALP活性明顯高于正常組。提示碳酸二甲酯具有肝臟毒性，可導致肝細胞排列紊亂、呈片狀壞死、胞核破碎溶解等器質(zhì)性改變和肝功能受損。

BUN和CREA是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，主要通過腎臟排泄。當腎臟受到化學、生物等損傷時，會導致濾過能力下降，進而引起血液中BUN、CREA迅速升高[26,27]。因此，分析血液中BUN、CREA水平可判斷腎臟損傷程度，預測治療效果。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)碳酸二甲酯吸入染毒小鼠的腎臟臟器系數(shù)、血液中BUN和CREA的含量均較正常組明顯升高，提示碳酸二甲酯具有較強的腎臟毒性。腎臟組織形態(tài)學分析也進一步證實染毒后的小鼠腎臟腎小管上皮細胞排列紊亂、呈片狀壞死、腎小球結構紊亂。此結果與Marchetti等[28]報道一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，碳酸二甲酯染毒后的小鼠小腸上皮細胞出現(xiàn)了充血水腫、排列雜亂，杯狀細胞及腺體減少等病理性損傷，證實小腸也可能是其損傷的靶器官之一。此外，我們還發(fā)現(xiàn)血液中RBC、PLT、NEU、EOS、LYM、BASO、WBC、MONO和HGB較正常組均出現(xiàn)了異常改變，推測碳酸二甲酯可能也對血液系統(tǒng)造成損害。

綜上所述，碳酸二甲酯吸入染毒具有較強的毒性，可引起實驗小鼠ECG和血液學指標異常改變，可導致肺、心、肝、小腸和腎出現(xiàn)病理學改變。本研究為碳酸二甲酯的職業(yè)危害防治提供了實驗依據(jù)。