血清EPCA-2與尿PCA3聯(lián)合檢測(cè)診斷PSA灰區(qū)前列腺癌的研究

聶 勇 王 超 吳江鋒 張德華 黃品信 楊興國(guó) 曹 君 張 宇 石文仲

(1. 宜昌市夷陵醫(yī)院 泌尿外科， 湖北 宜昌 443100； 2. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌 443002)

隨著我國(guó)人均壽命的不斷增長(zhǎng)與生活水平的逐步提高，男性前列腺癌的發(fā)病率出現(xiàn)快速上升。目前前列腺癌的診斷主要依據(jù)病史、直腸指診、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)檢測(cè)、經(jīng)直腸超聲檢查、磁共振檢查等，確診主要依靠前列腺穿刺活檢或病理學(xué)檢查。隨著研究的深入，臨床單一檢測(cè)PSA常發(fā)生不必要的誤診及漏診，檢測(cè)結(jié)果容易受到其他疾病或檢查的影響，特別是對(duì)PSA值在4～10 ng/mL的灰區(qū)患者，診斷結(jié)果缺乏特異性[1]。前列腺穿刺活檢為創(chuàng)傷性檢查，可能并發(fā)感染、出血、腫瘤種植及迷走神經(jīng)反射等并發(fā)癥[2]。隨著分子生物學(xué)、基因技術(shù)的發(fā)展，前列腺癌診斷的新型標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，多種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可以有效提高前列腺癌早期診斷的特異度和敏感度。早期前列腺癌抗原-2(early prostate cancer antigen-2，EPCA-2)是一種與前列腺癌相關(guān)的核基質(zhì)蛋白，有研究表明它能較病理切片提前5年或更早時(shí)間準(zhǔn)確地診斷出前列腺癌，提示其可作為前列腺癌篩查的腫瘤標(biāo)記物[3]。而前列腺癌抗原3(prostate cancer atigen 3，PCA3)，是前列腺癌特異性基因，在前列腺癌組織中呈高表達(dá)，在正常前列腺中表達(dá)水平較低，在其他正常組織、血液或其他腫瘤標(biāo)本中不表達(dá)[4]。為提高PSA灰區(qū)前列腺癌患者的早期診斷率，本研究擬探討聯(lián)合檢測(cè)血清EPCA-2與尿液中PCA3對(duì)早期診斷PSA灰區(qū)前列腺癌的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2016年2月～2020年10月收治的PSA灰區(qū)男性患者180例，包括前列腺癌組46例和前列腺良性增生組134例。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)中國(guó)前列腺癌診療指南，診斷金標(biāo)準(zhǔn)為前列腺穿刺活檢[2]，所有患者均經(jīng)直腸穿刺活檢病理確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①檢測(cè)前1周內(nèi)行導(dǎo)尿、前列腺按摩、直腸指診、經(jīng)尿道器械檢查操作；②1個(gè)月內(nèi)有前列腺穿刺、3個(gè)月內(nèi)有急慢性前列腺炎病史者；③有尿潴留、前列腺手術(shù)史及口服5α-還原酶抑制劑等藥物；④有其他腫瘤患者；⑤血清PSA不在4～10 ng/mL者。同時(shí)選取健康體檢者120例作為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署書面知情同意書。倫理批準(zhǔn)號(hào)：KY2016-01-2802。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

美國(guó)Biorad公司生產(chǎn)酶標(biāo)儀(型號(hào)為BR550)、杭州安譽(yù)科技有限公司生產(chǎn)AGS實(shí)時(shí)熒光PCR儀、廣州景頤光電科技有限公司產(chǎn)微量分光光度計(jì)721、瑞士羅氏公司生產(chǎn)電化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.2.2 主要試劑

EPCA-2酶聯(lián)免疫試劑盒由上海研吉生物科技有限公司生產(chǎn)；PCA3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 血清PSA的檢測(cè)

采集患者外周靜脈血5 mL，分離出血清，冷凍保存?zhèn)溆?。采用化學(xué)發(fā)光免疫染色法，按照PSA檢測(cè)試劑盒(瑞士羅氏公司生產(chǎn))說(shuō)明書檢測(cè)患者血清PSA含量。

1.4 血清EPCA-2的檢測(cè)

所有患者入院第2 d清晨空腹采血，收集血清標(biāo)本。所用的試管無(wú)熱原和內(nèi)毒素等，避免任何實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的刺激。血液采集后，3 000 rpm/min離心分離血清，標(biāo)本如果無(wú)法立即檢測(cè)可先于-20℃冰箱保存。采用 EPCA-2酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)三組患者血清EPCA-2水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中EPCA-2的濃度，繪制ROC曲線獲得閾值、敏感度及特異度。

1.5 尿液PCA3的檢測(cè)

囑患者排出晨尿后，適量飲水，當(dāng)有明顯尿意時(shí)，進(jìn)行前列腺按摩并收集尿液標(biāo)本。具體方法為傳統(tǒng)前列腺按摩法：患者取截石位，檢查者對(duì)其作直腸指診，當(dāng)觸及前列腺后，分別從左、右兩側(cè)葉對(duì)稱性地向中央溝方向用力按摩 3～4次，再?gòu)那傲邢俚撞肯蚣獠堪茨χ醒霚?3～4 次，然后囑患者排尿。采用高壓滅菌后的Rnase-free試管收集初始段尿液30 mL，3 000 rpm/min離心10 min，收集尿沉渣，加等量冷D-hanks液洗滌2次，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA的抽提：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，微量分光光度計(jì)測(cè)RNA的含量及A260/A280比值。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，采用RT-PCR半定量法檢測(cè)尿液PCA3的表達(dá)。PCA3引物序列為：上游引物TGGGAAGGACCTGATG ATACA，下游引物CCCAGGGATCTCTGTGCTT。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，以PCA3陽(yáng)性表達(dá)為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組、前列腺良性增生組和正常對(duì)照組基線資料

表1為三組的基本臨床資料。三組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。三組間血清PSA有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，前列腺癌組PSA高于正常對(duì)照組(P<0.05)。

表1 前列腺癌組、前列腺良性增生組和正常對(duì)照組基線資料比較

2.2 EPCA-2單獨(dú)鑒別前列腺癌和前列腺增生的診斷價(jià)值

與正常對(duì)照組相比，前列腺癌組與前列腺良性增生組EPCA-2均增高，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，見表1。繪制前列腺癌組與前列腺良性增生組血清EPCA-2的ROC曲線，以18.57 ng/mL為EPCA-2的閾值，其單獨(dú)鑒別前列腺癌和前列腺增生特異度為79.50%，敏感度為67.70%，見圖1。

圖1 前列腺癌組與前列腺增生組血清EPCA-2的ROC曲線

2.3 PCA3單獨(dú)鑒別前列腺癌和前列腺增生的診斷價(jià)值

PCA3在前列腺癌組中可見陽(yáng)性表達(dá)29例，17例為陰性；前列腺良性增生組可見陽(yáng)性表達(dá)8例，陰性126例；PCA3在前列腺癌組陽(yáng)性表達(dá)較高，在前列腺良性增生組中有少量陽(yáng)性表達(dá)，正常對(duì)照組均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，三組間陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PCA3單獨(dú)鑒別前列腺癌和前列腺增生的敏感度和特異度分別為63.04%和94.03%，見表2。

表2 前列腺癌組、前列腺良性增生組PCA3表達(dá)情況

2.4 EPCA-2、PCA3對(duì)PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷的效能分析

EPCA-2并聯(lián)PCA3對(duì)PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷，其敏感度為76.08%，特異度為85.82%，見表3。提示聯(lián)合檢測(cè)可用于PSA灰區(qū)前列腺癌與良性前列腺增生的鑒別診斷。

表3 EPCA-2、PCA3對(duì)PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷的效能分析

3 討論

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[5-7]，近年來(lái)在我國(guó)發(fā)病率亦呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[8-10]。目前PSA仍是臨床上用于篩查前列腺癌的主要檢測(cè)指標(biāo)。它是由前列腺腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的一種單鏈糖蛋白，具有組織特異性[1]。前列腺癌患者的血清PSA可有不同程度升高，但在各種前列腺炎、前列腺良性病變、急性尿潴留以及前列腺組織損傷性操作時(shí)也可出現(xiàn)PSA的反應(yīng)性增高，使得PSA檢測(cè)的特異性受到影響[10-14]。特別是在4～10 ng/mL(灰區(qū))時(shí)，PSA缺乏足夠的特異度和靈敏度，即便采用PSA相關(guān)衍生指標(biāo)如游離型PSA、結(jié)合型PSA、PSA速率、PSA密度等仍可能漏診，而此類患者前列腺穿刺活檢的陽(yáng)性率僅20%左右，重復(fù)穿刺或者篩查可能造成過(guò)度醫(yī)療，加重患者痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也不能從根本上解決PSA本身特異性低等問(wèn)題[1]。因此，尋找有效的腫瘤標(biāo)志物一直是泌尿外科研究的熱點(diǎn)。

近幾年，多種新型前列腺癌的診斷標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，采用多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可能是腫瘤診斷和早期篩查的趨勢(shì)，能夠提高前列腺癌的早期診斷率。EPCA-2是EPCA的亞型，是與前列腺癌相關(guān)的核基質(zhì)蛋白之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)，EPCA-2具有組織細(xì)胞特異性及腫瘤相關(guān)性，可以用于早期診斷前列腺癌。若以EPCA-2>30 ng/mL為前列腺癌的判定標(biāo)準(zhǔn)，總體上約94%的前列腺癌患者可以通過(guò)EPCA-2檢測(cè)出來(lái)[16]。提示EPCA-2可以作為前列腺癌篩查的腫瘤標(biāo)記物之一。

相較于血清PSA，PCA3為前列腺癌所特有，其水平不受前列腺疾病、前列腺或尿道侵入性操作等影響，可以作為比較可靠的前列腺癌的診斷標(biāo)志物。PCA3在前列腺癌中表達(dá)明顯增高，并可在多種體液，如血液、尿液、精液和前列腺液中檢出[17-20]。Merola等[21]發(fā)現(xiàn)，與tPSA及f/t PSA相比，PCA3診斷前列腺癌的準(zhǔn)確性更高，且PCA3評(píng)分與活檢陽(yáng)性率呈正相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于判斷首次前列腺穿刺活檢陰性，但血清PSA仍升高者是否需再次活檢時(shí)，PCA3檢測(cè)能發(fā)揮一定的作用[22]。當(dāng)PSA處于灰區(qū)時(shí)，尿PCA-3可幫助減少不必要的穿刺活檢，提高PSA灰區(qū)前列腺癌的診斷陽(yáng)性率[23]。

目前聯(lián)合檢測(cè)EPCA-2與PCA3用于PSA灰區(qū)前列腺癌診斷的研究較少[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組EPCA-2的含量較高，而前列腺增生組及正常對(duì)照組均偏低；以18.57 ng/mL為EPCA-2的閾值，其單獨(dú)鑒別前列腺癌和前列腺增生特異度為79.50%，敏感度為67.70%；尿液PCA3在前列腺癌組中可見陽(yáng)性表達(dá)29例，前列腺良性增生組8例，正常對(duì)照組均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。說(shuō)明尿液PCA3可鑒別出早期前列腺癌患者，但單一指標(biāo)存在一定局限性，可能引起漏診[25]。據(jù)此我們推測(cè)，聯(lián)合檢測(cè)EPCA-2及PCA3可以發(fā)揮協(xié)同診斷作用，結(jié)果表明EPCA-2并聯(lián)PCA3對(duì)PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷，其敏感度為76.08%，特異度為85.82%。本研究說(shuō)明EPCA-2和PCA3聯(lián)合檢測(cè)可用于PSA灰區(qū)前列腺癌與前列腺增生癥的早期篩查，提高診斷率，避免不必要的前列腺穿刺活檢。本研究由于受入組病例數(shù)的限制，研究結(jié)論仍有待于大樣本、多中心的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。