水中細(xì)菌ATP熒光檢測(cè)影響因素實(shí)驗(yàn)研究

王秋華，許元龍，王璐璐，張衛(wèi)風(fēng)

(華東交通大學(xué) 土木建筑學(xué)院，江西 南昌 330013)

飲用水輸布過(guò)程中，微生物會(huì)利用水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖，形成的生物膜會(huì)保護(hù)致病菌，嚴(yán)重威脅飲用水安全[1]。ATP熒光檢測(cè)法作為水中細(xì)菌含量的主要評(píng)價(jià)方法[2-6]，具有快速、廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單，且可在低水平下檢測(cè)(濃度為1 ng/L的ATP不需濃縮，可直接檢測(cè))的優(yōu)勢(shì)，因而具有廣闊的應(yīng)用前景[7-9]。Van等采用ATP、AOC等多個(gè)指標(biāo)測(cè)定慢沙過(guò)濾后成品水的微生物生長(zhǎng)潛力，發(fā)現(xiàn)ATP與AOC相關(guān)性良好[10]。

本文主要研究了發(fā)光反應(yīng)條件、水質(zhì)條件和試劑存放條件對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，以期可更好地利用ATP發(fā)光檢測(cè)技術(shù)確定飲用水的生物穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

FeSO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、NaCl、NaAc·3H2O均為分析純；螺旋菌NOX(Spirillumsp.)，購(gòu)自北納生物微生物菌種保藏中心；ATP可檢測(cè)試劑，由BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate的混合液組成；GLOMAXTM20/20檢測(cè)試劑，購(gòu)自 Promega 公司。

GLOMAXTM20/20發(fā)光檢測(cè)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2 000 μg/L碳當(dāng)量培養(yǎng)液的配制 2 000 μg/L碳當(dāng)量的培養(yǎng)液配方見(jiàn)表1。按照配方溶解藥品，并定容到1 L。將培養(yǎng)液分裝到200 mL的錐形瓶中，每瓶10 mL，在115 ℃滅菌20 min。

表1 2 000 μg/L碳當(dāng)量的培養(yǎng)液配方

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)液制備 將NOX菌落接種到 2 000 μg/L 碳當(dāng)量的培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng) 16 d，低溫4 ℃冷藏保存3個(gè)月，作為細(xì)菌培養(yǎng)液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 利用GLOMAXTM20/20發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)試ATP指標(biāo)。測(cè)試結(jié)果有兩種表達(dá)方式。其中一種方式是ATP產(chǎn)生的熒光相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度RLU；另一種方式是通過(guò)測(cè)試已知量的ATP標(biāo)樣的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，將測(cè)試樣發(fā)光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成ATP物質(zhì)的量(nmol/L)。本文采用RLU值表示ATP。

1.2.3.1 常規(guī)檢測(cè)方法 室溫條件下，按照說(shuō)明要求將BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate兩種測(cè)試試劑混合。取定量配好后的測(cè)試試劑，加入樣品混合5 min后的讀數(shù)，即是所測(cè)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)值。

常規(guī)ATP檢測(cè)，發(fā)光試劑與樣品的發(fā)光反應(yīng)時(shí)間需要5 min，才會(huì)得到穩(wěn)定的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度讀數(shù)。讀數(shù)并不影響發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行，所以為了盡量縮短ATP測(cè)試時(shí)間，將試劑與水樣混合后直接采用間隔5 s連續(xù)讀數(shù)的方式。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的ATP檢測(cè)方法。

1.2.3.2 改進(jìn)ATP檢測(cè)方法 如上配好試劑并加樣后，立即將混合液放入儀器中連續(xù)讀數(shù)，設(shè)置間隔5 s，連續(xù)手動(dòng)讀數(shù)模式，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)光反應(yīng)條件的影響

25 ℃條件下，分別將 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL 原菌液與50 μL檢測(cè)試劑在1.5 mL的滅菌離心管中混合，立即放入GLOMAXTM 20/20發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，得到1.5 μL和2.5 μL原菌液測(cè)試發(fā)光反應(yīng)到穩(wěn)定期的兩條數(shù)據(jù)記錄曲線(圖1)，和發(fā)光反應(yīng)5 s結(jié)果(圖2，第1次讀數(shù)結(jié)果)與發(fā)光最大值(圖3，發(fā)光穩(wěn)定期內(nèi)，在每組連續(xù)6次讀數(shù)中，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)讀數(shù)為最大值時(shí)，即將其定為最大值)結(jié)果的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 細(xì)菌培養(yǎng)液ATP熒光檢測(cè)結(jié)果

由圖1可知，菌液添加量為1.5 μL樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度在前3次讀數(shù)過(guò)程中快速上升至 7 418 RLU，隨后上升速度減緩，并于第8次讀數(shù)時(shí)開(kāi)始穩(wěn)定在8 501 RLU左右。菌液添加量為2.5 μL樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度在前3次讀數(shù)中迅速增至 11 761 RLU，隨后增加趨勢(shì)減緩，并于第9次讀數(shù)后穩(wěn)定在 13 482 RLU 附近。雖然菌液量不同，但相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)與達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間均相似，即ATP試劑與樣品的發(fā)光反應(yīng)初期發(fā)光強(qiáng)度迅速變大，反應(yīng)到達(dá)一定程度后，發(fā)光強(qiáng)度基本保持恒定。

同一次測(cè)試的結(jié)果得到圖2、圖3兩條菌量與ATP相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是根據(jù)5 s讀數(shù)建立的，圖3是根據(jù)最大值讀數(shù)建立的。結(jié)果表明，雖然發(fā)光反應(yīng)初期光強(qiáng)增長(zhǎng)劇烈，但對(duì)其發(fā)光強(qiáng)度與菌量間的相關(guān)性影響很小。即使發(fā)光反應(yīng)僅有 5 s 時(shí)，其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值和細(xì)菌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值仍達(dá)到0.979 04，5 s讀數(shù)能夠在一定程度上表征細(xì)菌量，并且使ATP測(cè)試時(shí)間顯著縮短。圖3是根據(jù)最大值建立的細(xì)菌量與ATP相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R2值為0.993 89。通過(guò)比較5 s發(fā)光值(圖2)和最大發(fā)光值(圖3)與細(xì)菌ATP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)最大值標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度更好，更能準(zhǔn)確反應(yīng)ATP相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與菌量的關(guān)系。

圖2 5 s發(fā)光值與接種菌液量擬合結(jié)果

圖3 最大發(fā)光值與接種菌液量擬合結(jié)果

2.2 水質(zhì)條件的影響

水質(zhì)三個(gè)類(lèi)型分別是純水(JC)、龍頭水(L)及細(xì)菌培養(yǎng)液(J)。對(duì)于龍頭水的測(cè)試，采用接菌龍頭水(JL)減去接種前龍頭水(L)數(shù)據(jù)的方法，去掉龍頭水原本所含細(xì)菌的量的影響，即為折算接菌龍頭水(JL-L)。每種水質(zhì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。對(duì)于接菌純水和接菌龍頭水，水樣與其所加細(xì)菌培養(yǎng)液的比值為200 μL∶10 μL，ATP檢測(cè)試劑與加樣的比值為 50 μL∶50 μL；對(duì)于不接菌龍頭水，ATP檢測(cè)試劑與加樣的比值為50 μL∶50 μL；對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)液，ATP檢測(cè)試劑與加樣的比值為50 μL∶2.5 μL；每種水樣的檢測(cè)設(shè)3次重復(fù)。這樣的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，保障了龍頭水、純水及細(xì)菌培養(yǎng)液每次檢測(cè)樣本的菌量都為 2.5 μL 細(xì)菌培養(yǎng)液，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的是相同的細(xì)菌菌量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水樣ATP熒光檢測(cè)活力結(jié)果

由表2可知，3次重復(fù)測(cè)試結(jié)果的變化幅度龍頭水為106 RLU，接菌龍頭水為1 568 RLU，接菌純水為963 RLU，細(xì)菌培養(yǎng)液為528 RLU，表明所測(cè)樣品中細(xì)菌活力的穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱依次是龍頭水>細(xì)菌培養(yǎng)液>接菌純水>接菌龍頭水。未接菌龍頭水和細(xì)菌培養(yǎng)液的測(cè)試結(jié)果變化幅度相對(duì)較小，兩者所含細(xì)菌都是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期生長(zhǎng)穩(wěn)定后的狀態(tài)，細(xì)菌的活力基本保持在穩(wěn)定值范圍內(nèi)。而接菌龍頭水和接菌純水的變化幅度都較大，說(shuō)明細(xì)菌進(jìn)入新的生長(zhǎng)環(huán)境后，其生長(zhǎng)活力會(huì)發(fā)生變化，變化幅度與水質(zhì)因素有關(guān)系。

此外，表2列出了各水樣ATP檢測(cè)的平均值，其中接菌龍頭水(JL)為 18 534 RLU，折算接菌龍頭水(JL-L)為 16 524 RLU，接菌純水(JC)為 23 609 RLU 及細(xì)菌培養(yǎng)液(J)為13 820 RLU。雖然折算接菌龍頭水、接菌純水及細(xì)菌培養(yǎng)液所測(cè)樣品中的細(xì)菌含量相同，但三種水樣的測(cè)試結(jié)果卻有明顯差異。接菌龍頭水未減去本身所含細(xì)菌量時(shí)，其測(cè)試值就明顯小于接菌純水的測(cè)試值，這證明并不是龍頭水本身所含菌量導(dǎo)致上述明顯差異。并且相比于接菌龍頭水和折算接菌龍頭水，接種純水與細(xì)菌培養(yǎng)液間的差異更大?？芍|(zhì)對(duì)ATP檢測(cè)結(jié)果會(huì)有明顯影響，并且純水對(duì)其影響的程度要大于龍頭水。分析導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的原因，應(yīng)是細(xì)菌接種到新環(huán)境中，其能量代謝系統(tǒng)受到營(yíng)養(yǎng)條件變化的影響，從而導(dǎo)致細(xì)菌ATP量發(fā)生變化。

2.3 試劑存放條件的影響

檢測(cè)試劑采用BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate的混合液，室溫下使用?，F(xiàn)配試劑與連續(xù)使用試劑(25 ℃，光照2 d)對(duì)不同濃度菌液進(jìn)行ATP熒光檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同試劑存放條件的ATP熒光檢測(cè)結(jié)果

由圖4可知，在接種1 μL菌液條件下，采用連續(xù)使用的檢測(cè)試劑所得檢測(cè)結(jié)果為6 057 RLU，而采用現(xiàn)配試劑的檢測(cè)結(jié)果為 10 453 RLU，相差 4 396 RLU。隨著接種量的增加，兩種試劑的檢測(cè)差值由4 396 RLU增加至13 787 RLU，即連續(xù)使用的試劑檢測(cè)結(jié)果比現(xiàn)配試劑檢測(cè)結(jié)果低了40%～50%。表明室溫有光條件下，長(zhǎng)時(shí)存放檢測(cè)試劑會(huì)顯著降低ATP熒光檢測(cè)的發(fā)光強(qiáng)度，導(dǎo)致錯(cuò)誤判斷飲用水中生物量?？紤]到檢測(cè)試劑的發(fā)光能力在連續(xù)使用中會(huì)衰變，建議檢測(cè)樣本的同時(shí)，定時(shí)利用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)曲線的轉(zhuǎn)換系數(shù)，將每個(gè)時(shí)段所測(cè)的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度換算為ATP物質(zhì)的量，以ATP物質(zhì)的量作為生物量指標(biāo)。

3 結(jié)論

研究了檢測(cè)發(fā)光時(shí)間、水質(zhì)條件及試劑存放條件對(duì)ATP熒光檢測(cè)準(zhǔn)確性的影響。在25 ℃條件下，采用5 s間隔連續(xù)讀數(shù)方式，記錄最大值作為測(cè)試結(jié)果。這種讀數(shù)方式既可以節(jié)省測(cè)試時(shí)間，又能夠保證測(cè)試準(zhǔn)確性。測(cè)試時(shí)若需要稀釋?zhuān)♂層玫娜軇?huì)在一定程度上干擾測(cè)試結(jié)果。不同水質(zhì)會(huì)導(dǎo)致ATP測(cè)試結(jié)果的差異，這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究水質(zhì)生物穩(wěn)定性具有一定意義。鑒于ATP試劑會(huì)因存放條件而衰變，在一定時(shí)間和溫度條件下，增加對(duì)ATP標(biāo)樣相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)，將相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成ATP物質(zhì)的量，并以此作為生物量的表征指標(biāo)。