糠醛渣與磺化糠醛渣復(fù)合材料固定HRP降解苯酚

畢淑嫻，郝紅英，雷文雅，詹海鵑，劉萬(wàn)毅

(省部共建煤炭高效利用與綠色化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心寧夏大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

酚類化合物是工業(yè)上常見(jiàn)的有毒有機(jī)污染物，含酚廢水在我國(guó)水污染控制中被列為重點(diǎn)解決的有害廢水之一，它的大量排放對(duì)土壤和水體造成嚴(yán)重的污染，嚴(yán)重危害動(dòng)植物和人類的健康[1]。隨著工業(yè)的發(fā)展，含酚廢水的種類與數(shù)量都日益增加，廢水治理也是科學(xué)工作者急需解決的環(huán)保問(wèn)題[2-3]。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是一種從植物中提取出來(lái)的過(guò)氧化物酶[4]，在過(guò)氧化氫或其他有機(jī)過(guò)氧化物存在下，可以催化芳香族化合物的氧化，被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、聚合物合成、含酚類化合物廢水的處理等各個(gè)方面[5-6]。所謂固定化酶，是指通過(guò)物理或化學(xué)方法將酶固定在一定空間范圍內(nèi)，酶仍能保持其高效的催化性能，并能反復(fù)、連續(xù)使用的酶[7-9]。與游離酶相比，固定化酶具有保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性，尋找高效恰當(dāng)?shù)妮d體材料和有效的固定方法仍是該領(lǐng)域值得研究的大問(wèn)題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

糠醛渣，工業(yè)級(jí)；殼聚糖(CTS)、辣根過(guò)氧化物酶均為生化試劑；冰乙酸、戊二醛、4-氨基安替比林、苯酚、30%過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純；純凈水(1.5 L，娃哈哈)。

PSHJ-5酸度計(jì)；UV-1800PC紫外分光光度計(jì)；KQ-250E超聲波清洗器；BC/BD-111HC冰箱；JD200-4電子分析天平；SHA-C數(shù)顯恒溫振蕩器；KA-1.0離心機(jī)。

1.2 兩種交聯(lián)糠醛渣材料的制備

1.2.1 糠醛渣復(fù)合材料制備 稱取1 g糠醛渣(40～60 m)，加入10 mL 3%的殼聚糖溶液，磁力攪拌12 h，靜置。倒去上清液，洗滌至中性，過(guò)濾，在 80 ℃ 烘干。輕微研磨，得FR-CTS材料。

1.2.2 磺化糠醛渣復(fù)合材料制備

1.2.2.1 糠醛渣的磺化 稱1 g糠醛渣(40～60目)于釜內(nèi)膽，邊磁力攪拌，邊滴加3 mL濃硫酸，攪拌30 min，靜置48 h。于烘箱內(nèi)150 ℃下反應(yīng) 4 h，冷卻至室溫。水洗至中性，過(guò)濾，將其在80 ℃烘干。輕微研磨，得磺化糠醛渣材料SFR。

1.2.2.2 SFR-CTS材料制備 稱取1 g磺化糠醛渣，加入10 mL 3%的殼聚糖溶液，磁力攪拌12 h，靜置。倒去上清液，洗滌至中性，過(guò)濾，在80 ℃烘干。輕微研磨，得SFR-CTS材料。

1.2.3 交聯(lián)糠醛渣材料的制備 稱取FR-CTS材料和SFR-CTS渣材料各1 g，加入20 mL 3%的戊二醛溶液，磁力攪拌8 h，靜置。洗去多余的戊二醛，洗滌3～5次，置烘箱80 ℃烘干，研磨，得到交聯(lián)糠醛渣復(fù)合材料(FR-CTS-GA)和交聯(lián)的磺化糠醛渣復(fù)合材料(SFR-CTS-GA)。

1.3 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA固載酶的制備

1.3.1 0.1 mol/L pH=5.0，6.0，7.0，8.0，9.0磷酸鹽緩沖液配制 分別稱取磷酸氫二鈉17.91 g，磷酸二氫鈉7.801 g，溶解于500 mL去離子水。使用時(shí)按比例混合，并調(diào)節(jié)到相應(yīng)pH。

1.3.2 1 mg/mL辣根過(guò)氧化物酶溶液配制 準(zhǔn)確稱取10 mg 辣根過(guò)氧化酶，溶解于10 mL pH=7.0磷酸鹽緩沖液中。分裝在數(shù)個(gè)離心管中，置于冰箱凍存。使用時(shí)稀釋到相應(yīng)比例。

1.3.3 固載酶的制備 分別準(zhǔn)確稱取10 mg FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA用pH=7.0磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，超聲處理5 min，得到1 mg/mL均一的FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA水溶液。分別加入0.2 mg/mL HRP酶溶液和pH=7.0 的磷酸鹽緩沖液，將各樣品混合均勻后密封，在冰浴條件下置于恒溫振蕩器上固載2 h。

1.4 HRP酶催化降解苯酚

1.4.1 0.8 mol/L苯酚溶液50 mL配制 稱取 3.765 g 苯酚，依次加入12.5 mL 無(wú)水乙醇，37.5 mL pH=7.0 磷酸鹽緩沖液，置于棕色試劑瓶冷藏保存。

1.4.2 39.3 mmol/L 4-氨基安替比林50 mL配制 稱取0.399 g 4-氨基安替比林，加入50 mL去離子水，置于棕色試劑瓶中冷藏保存(每隔1周重新配制1次)。

1.4.3 30 mmol/L過(guò)氧化氫50 mL配制 取30%(m/m)過(guò)氧化氫155 μL，去離子水定容至50 mL，置于棕色試劑瓶中冷藏保存(每隔1周重新配制1次)。

1.4.4 苯酚的催化降解 pH=7.0條件下，加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mo/L過(guò)氧化氫，再加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液，使得整個(gè)反應(yīng)體系為1 mL，在30 ℃下降解反應(yīng)12 h，考察苯酚去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 載體的表征

2.1.1 FR和SFR-CTS-GA的紅外譜圖 見(jiàn)圖1。

圖1 FR和SFR-CTS-GA的紅外譜圖

2.1.2 糠醛渣和磺化糠醛渣復(fù)合材料的光電子能譜 糠醛渣和磺化糠醛渣復(fù)合材料的光電子能譜見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 糠醛渣的光電子能譜圖

圖3 FR-CTS-GA的光電子能譜

圖4 SFR-CTS-GA的光電子能譜

根據(jù)能譜中特征峰掃描譜的峰面積，結(jié)合靈敏度因子，可求得糠醛渣、FR-CTS-GA、SFR-CTS-GA表面各組分的原子個(gè)數(shù)比及質(zhì)量比，其定量分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA光電子能譜元素分析

由譜圖及光電子能譜元素分析可知，糠醛渣、FR-CTS-GA、SFR-CTS-GA均檢出C、O、N元素，其中O 1s元素含量分別為31.86%，30.53%，29.11%，C 1s 元素含量分別為67.75%，68.32%，66.42%，SFR-CTS-GA檢出S元素，接入了磺酸基，成功磺化。

圖5為FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA表面C 1s的高分辨波譜。

圖5 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA表面C 1s的高分辨波譜

由圖5可知，C 1s有4個(gè)峰：C Ⅳ(281 eV)，脂肪烴碳原子；C Ⅱ(282.3 eV)，與酚類、醇類、醚類相連的碳；C Ⅲ(283.3 eV)，羰基中碳；C Ⅰ(285.8 eV)，碳酸鹽或吸附的CO和CO2中的碳。

2.2 HRP的固載

2.2.1 固載酶的熱穩(wěn)定性 溫度是酶在使用過(guò)程中影響其使用效果的重要因素之一，溫度的變化會(huì)影響到酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響到酶活性。因此需要考察不同溫度下游離酶和固載酶的的酶活力。取游離酶和兩種固載酶樣品各5個(gè)，在其余條件不變的前提下，在20～60 ℃的溫度范圍內(nèi)測(cè)定各樣品活性，以相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 溫度對(duì)固載及游離酶的影響

由6圖可知，游離酶在40 ℃時(shí)酶活性最高， SFR-CTS-GA固載酶和FR-CTS-GA固載酶最高酶活性也在40 ℃。在高溫時(shí)，固載酶的熱穩(wěn)定性較游離酶有了提高，這可能是由于高溫時(shí)游離酶的酶構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致活性喪失，而固載酶避免了在熱量傳導(dǎo)過(guò)程中造成酶結(jié)構(gòu)變形或損壞。

2.2.2 固載酶的時(shí)間穩(wěn)定性質(zhì) 取兩種固載酶平行樣品，在0.1 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液中于 4 ℃ 冷藏避光保存，每隔一段時(shí)間取出進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)固載的影響

由圖7可知，兩種固載酶的半衰期為10 d，儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好，F(xiàn)R-CTS-GA固載酶的穩(wěn)定性相對(duì)更好，SFR-CTS-GA固載酶保存15 d后，活性僅為原來(lái)的33%，而FR-CTS-GA固載酶在相同條件下，活性降為原來(lái)39.7%。這可能是由于交聯(lián)時(shí)戊二醛過(guò)量所造成的。兩種載體通過(guò)戊二醛進(jìn)行交聯(lián)之后，本應(yīng)該穩(wěn)定性更強(qiáng)，但過(guò)量的戊二醛會(huì)影響HRP空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，甚至扭曲HRP的特定活性位點(diǎn)，導(dǎo)致酶的構(gòu)象發(fā)生變化，造成酶活性的下降，還會(huì)影響到載體表面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶不易被固定。

2.2.3 固載酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 固定測(cè)定酶活力溶液中的過(guò)氧化氫濃度，只改變苯酚的濃度，其他條件均相同。測(cè)定不同的苯酚濃度下的體系的吸光度，轉(zhuǎn)換為酶促反應(yīng)速率，以苯酚濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，測(cè)得的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖求得Km值。三種酶樣品的Lineweaver-Burk曲線見(jiàn)圖8。

圖8 游離酶與固載酶的Lineweaver-Burk曲線

由表2可知，游離酶與固載酶的Km值相對(duì)大小為FR-CTS-GA固載酶

表2 游離酶與固載酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 HRP酶催化降解苯酚

2.3.1 溫度的影響 pH=7.0條件下，加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 過(guò)氧化氫，再加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液，使得整個(gè)反應(yīng)體系為1 mL，分別在20，30，40，50，60 ℃條件下反應(yīng)12 h，考察苯酚去除率隨溫度的變化趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 溫度對(duì)固載及游離酶降解苯酚的影響

由圖9可知，40 ℃之前游離酶和固載酶對(duì)苯酚的去除率都隨溫度上升而增加，40 ℃之后游離酶的去除率開(kāi)始迅速下降，這是由于在較高溫度時(shí)，游離酶的活性大大降低的緣故；固載酶對(duì)苯酚的降解率整體高于相應(yīng)溫度下游離酶對(duì)苯酚的降解率，說(shuō)明酶固定化后所得的固載酶具有耐高溫性，在溫度較高時(shí)，依然可以保持較好的性能。去除率隨溫度的變化趨勢(shì)與酶活性隨溫度的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明苯酚去除率的變化主要與酶活性隨溫度變化有關(guān)。

2.3.2 pH的影響 固載后的HRP對(duì)pH穩(wěn)定性高，在pH=4～10都有一定催化活性。加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 過(guò)氧化氫，分別加入pH=5～9的緩沖溶液使整個(gè)反應(yīng)體系為1 mL，在30 ℃下降解反應(yīng)12 h，pH對(duì)苯酚去除率的影響見(jiàn)圖10。

圖10 pH對(duì)固載及游離酶降解苯酚的影響

由圖10可知，苯酚降解率隨pH增大而增大，在pH=8時(shí)達(dá)到最大降解率，隨后降解率隨pH增大而減小。而固載酶對(duì)苯酚的降解率整體受pH的影響較小，堿性條件下，固載酶對(duì)苯酚的降解率高于游離酶對(duì)苯酚的降解率。

2.3.3 苯酚濃度的影響 分別加入5，10，15，20，25，30 μL濃度為0.08 moL/L的苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 過(guò)氧化氫，再加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液，使得整個(gè)反應(yīng)體系為1 mL，在30 ℃下降解反應(yīng)12 h，苯酚去除率隨著苯酚初始濃度的變化見(jiàn)圖11。

圖11 濃度對(duì)固載及游離酶降解苯酚的影響

由圖11可知，隨著苯酚初始濃度增加，固載酶對(duì)苯酚的催化去除逐漸降低。總體來(lái)看，固載酶比游離酶受苯酚濃度影響較小，SFR-CTS-GA固載酶催化降解苯酚的效率更高。由此可知，固定化酶適宜處理低濃度含酚廢水，對(duì)于高濃度含酚廢水，還需進(jìn)行預(yù)處理，使苯酚濃度降低，再進(jìn)行二級(jí)處理，達(dá)到排放要求。

3 結(jié)論

以糠醛渣和磺化糠醛渣為載體，與殼聚糖組合，形成復(fù)合材料，使用戊二醛作為交聯(lián)劑，對(duì)復(fù)合載體材料進(jìn)行交聯(lián)，與適當(dāng)濃度的HRP酶液混合，冰浴振蕩得到固載酶。固載酶在pH=7，40 ℃時(shí)有最高活性，在高溫條件下，固載酶活性高于游離酶，兩種固載酶在使用完第一次后活性就大大降低，而總體來(lái)看，SFR-CTS-GA固載酶的重復(fù)利用效果更好一些。固載酶在pH=8，40 ℃條件下對(duì)苯酚的催化效率最高，固載酶具有更寬的pH適用范圍，堿性條件下，固載酶對(duì)苯酚的降解率高于游離酶。在高溫條件下，兩種固載酶對(duì)苯酚的催化能力優(yōu)于游離酶。苯酚起始濃度為1.6 mmol/L，在30 ℃下反應(yīng)12 h，SFR-CTS-GA固載酶和FR-CTS-GA固載酶對(duì)苯酚的去除率可以達(dá)到92%，85%。