鼻淵凈膠囊的HPLC指紋圖譜研究

程艷芹，朱 姍，李明春，張玉杰，付青姐 （中國人民解放軍海軍第九七一醫(yī)院藥劑科，山東 青島，266071）

鼻淵凈膠囊為純中藥內(nèi)服制劑[批準(zhǔn)文號：總制字（2016）F405004]，由蒼耳子、辛夷、連翹、白芷、羌活、野菊花等六味中藥組成，具有散風(fēng)消炎、宣通鼻竅、稀化鼻竇與氣管粘稠分泌物的功效，主要用于鼻淵的治療。由于該制劑原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定年代久遠(yuǎn)，質(zhì)量控制僅有白芷一味藥材的薄層鑒別，主要藥味均無含量測定項，不能較好地反映制劑質(zhì)量，本課題組前期對其原有的工藝參數(shù)進行了優(yōu)選[1]，并進行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加了辛夷、連翹、羌活、野菊花四味藥的薄層定性鑒別，并建立了辛夷中木蘭脂素、連翹中連翹苷、白芷和羌活中歐前胡素、野菊花中蒙花苷等主要成分的HPLC含量測定[2]，本研究在此基礎(chǔ)上，建立了鼻淵凈膠囊的HPLC指紋圖譜，擬從多成分角度對其質(zhì)量進行全面控制，進一步保證制劑的質(zhì)量均一和臨床用藥安全。

1 材料與試藥

1.1 實驗儀器

Agilent 1 260高效液相色譜儀，含G1329A自動進樣器、G4212B DAD檢測器（美國，Agilent公司）；JM-B2102型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司）；FA1605型電子天平（上海橫平儀表廠）；KH-100B型超聲波清洗器（昆山和創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑

10個批次(標(biāo)記為S1～S10)的鼻淵凈膠囊樣品（批號：150901、150902、150904、150905、150910、150913、150916、150920、150921、150923，本院制劑室自制）；連翹苷（批號：110753-201314）、蒙花苷（批號：110805-200508）、木蘭脂素（批號：110780-201007）、歐前胡素（批號：111730-201307）、異歐前胡素（批號：111640-201005）等對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為自制純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備[3-8]

2.1.1 供試品溶液

取鼻淵凈膠囊內(nèi)容物適量，研碎，精密稱取粉末約1 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，加甲醇補足損失重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液

分別取紫花前胡苷、連翹苷、蒙花苷、木蘭脂素、歐前胡素和異歐前胡素對照品各10 mg，精密稱定，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密量取1 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 單味藥材溶液

分別取野菊花、連翹、蒼耳子、辛夷、羌活、白芷單味藥材適量，按照鼻淵凈膠囊的制備方法及供試品溶液的制備方法，制備各單味藥的樣品溶液。

2.2 色譜條件與方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫：0～5 min，20% A；5～15 min，20%～30% A；15～35 min，30%～40% A；35～50 min，40%～50% A；50～70 min，50%～55% A；70～80 min，55% A；流速：1.0 ml/min；檢測波長210 nm；進樣量10 μl。

2.2.2 方法學(xué)考察[9～20]

精密度試驗：取鼻淵凈膠囊S1號樣品（批號：150901）膠囊內(nèi)容物，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，用“2.2.1”項下的色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜，以峰9為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

重復(fù)性試驗：取鼻淵凈膠囊S1號樣品（批號：150901）膠囊內(nèi)容物，共6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，用“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以峰9為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

穩(wěn)定性試驗：取同一S1號樣品（批號：150901）的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h依法進樣測定，以峰9為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

2.3 指紋圖譜的建立、相似度的評價及部分共有峰的歸屬

取鼻淵凈膠囊S1～S10號共10批樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，用“2.2.1”項下色譜條件測定，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”進行分析。

根據(jù)10批供試品溶液的色譜峰生成參照圖譜，選擇參照圖譜中峰面積大于500且分離度較好的峰為共有指紋峰，分析確定鼻淵凈膠囊的共有指紋峰。

釆用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》評價10批鼻淵凈膠囊的圖譜的相似性，并進行綜合評價。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗結(jié)果顯示各共有峰平均相對保留時間的RSD為0.62%，平均相對峰面積的RSD為1.17%，在該方法下的精密度良好；重復(fù)性試驗結(jié)果顯示各共有峰平均相對保留時間的RSD為0.29%，平均相對峰面積的RSD為1.15%，在該方法下重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示各共有峰平均相對保留時間的RSD為0.90%、平均相對峰面積的RSD為1.10%，樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 指紋圖譜的建立

以批號150 901（S1）的指紋圖譜作為參照譜，多點校正，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 10批樣品的HPLC特征圖譜疊加圖

3.3 確定共有指紋峰

分析結(jié)果確定鼻淵凈膠囊有20個共有指紋峰，其中峰9為鼻淵凈膠囊的指標(biāo)成分木蘭脂素，該峰吸收信號最強、保留時間適中，峰形較好且穩(wěn)定，故將其作為參照峰。鼻淵凈膠囊指紋圖譜見圖2。

圖2 鼻淵凈膠囊HPLC指紋圖譜

3.4 共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積

比較10批鼻淵凈膠囊的色譜圖，以木蘭脂素峰（峰9）的保留時間和色譜峰面積為1，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表1和表2。

表1 10批次鼻淵凈膠囊指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批次鼻淵凈膠囊指紋圖譜共有峰的相對峰面積

3.5 指紋相似度評價

指紋相似度在0.9～1.0之間，各批次之間的相似性較強，說明鼻淵凈膠囊的制備工藝及樣品分析方法穩(wěn)定可行，相似度結(jié)果見表3。

表3 10批次鼻淵凈膠囊HPLC指紋圖譜相似度

3.6 部分共有峰的鑒定及歸屬分析

3.6.1 共有峰的鑒定

采用對照品對照法對共有峰進行確認(rèn)，取“2.1”項下配制的各對照品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，在對照品溶液保留時間處，供試品溶液的色譜峰與對照品色譜峰的在線UV圖一致，由此來判斷共有峰化學(xué)成分的歸屬。通過此方法，判斷4號峰為連翹苷，5號峰為蒙花苷，9號峰為木蘭脂素，15號峰為歐前胡素，17號峰為異歐前胡素（見圖3）。

圖3 鼻淵凈膠囊與蒙花苷HPLC疊加圖及蒙花苷的UV光譜圖

3.6.2 藥味歸屬分析

采用各單味藥陽性對照試驗，取“2.1”項下各單味藥材溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行測定。通過比較各色譜峰的保留時間和UV光譜圖，對鼻淵凈膠囊樣品中共有峰的來源進行追溯。結(jié)果表明，峰1、2、4、6、7來自連翹，峰5來自野菊花，峰8～13來自辛夷，峰15、17、20來自白芷，其中峰17、20為羌活和白芷的共有峰。

4 討論

在預(yù)實驗中，曾嘗試多種不同的溶劑系統(tǒng)作為流動相，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸，發(fā)現(xiàn)選用甲醇-水時，基線總是漂移；選用乙腈-水時，乙腈比甲醇的洗脫效果更明顯，且加入酸溶液并不能改善峰型、基線平穩(wěn)，各峰的峰型和分離度均良好，故選擇乙腈-水作為流動相。經(jīng)過對供試品采用DAD檢測器進行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，在210 nm波長下供試品溶液圖譜的信息量較多、各吸收峰強度較大，故最終選擇210 nm作為鼻淵凈膠囊HPLC指紋圖譜的檢測波長。

對中成藥的評價需要全面方能準(zhǔn)確反映制劑質(zhì)量。本研究采用HPLC法，建立了以木蘭脂素為參照物的鼻淵凈膠囊的指紋圖譜，標(biāo)定了21個共有指紋峰，指認(rèn)了5個成分，10批次樣品指紋圖譜整體的相似性結(jié)果在0.9以上。在此次建立的鼻淵凈膠囊HPLC-UV指紋圖譜中，蒼耳子藥材的特征性成分表達很少，可能是因為其特征性成分在該波長下紫外吸收較少，或者是受其他成分的影響未能表達，此不足考慮在以后的研究中運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其成分進行分析與檢測來彌補[21-22]，從而為鼻淵凈膠囊的質(zhì)量評價提供更全面可靠的依據(jù)。