鐮形棘豆總黃酮的含量測定方法研究

劉曉玲，楊育儒，蔡小輝，陳錦珊 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院藥劑科，福建漳州 363000）

鐮形棘豆（Oxytropis falcateBunge）系豆科棘豆屬多年生無莖草本植物。據(jù)《晶珠本草》記載，鐮形棘豆以根及根莖或全草入藥，被譽(yù)為“草藥之王”，是我國青藏高原常用的民間草藥之一[1]。研究表明鐮形棘豆主要活性成分有黃酮類、生物堿類、多糖類等[2]，其中黃酮類具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抑菌等生物活性，在抗腫瘤、抗2型糖尿病及防紫外線曬傷等領(lǐng)域已有較多的文獻(xiàn)報道[3-4]。因此，尋找適宜的鐮形棘豆總黃酮含量測定方法對其進(jìn)一步研究具有重要意義。

目前，中藥中黃酮含量測定的常用方法有高效液相色譜法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]和紫外可見分光光度法[8-13]。其中前兩種方法用于測定黃酮單體，而紫外分光光度法則用于測定總黃酮。近年來，金屬離子絡(luò)合法[8-13]已成為總黃酮含量測定應(yīng)用最廣泛的方法[10]，其原理是在酸性或堿性條件下，金屬離子與黃酮發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成不同顏色的金屬螯合物，再在紫外或可見光區(qū)用比色法測定其含量[10]，常用的顯色劑有氯化鋁和硝酸鋁。鐮形棘豆總黃酮含量測定方法研究未見報道，本文以蘆丁為對照品，對氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法直接測定總黃酮進(jìn)行考察，以期建立適用于鐮形棘豆總黃酮的含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUX220電子分析天平、2550紫外可見分光光度計（日本島津）；LD5-2A低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市江南儀器廠）；SY-176華美冷柜（杭州華美電冰箱廠）。

1.2 試藥

鐮形棘豆（青海西寧，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院鄭紹忠副主任藥師鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆）；蘆丁對照品（純度92.6%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707）；95%乙醇、氫氧化鈉、醋酸鈉、氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐮形棘豆總黃酮的提取及純化[14-15]

精密稱取適量鐮形棘豆粗粉，置圓底燒瓶中，加入20倍量66%乙醇回流提取2次，每次84 min，過濾，合并濾液，即為上樣液。以D-101大孔樹脂上柱，上樣濃度為275 mg/g，洗脫劑為80%乙醇，洗脫液減壓濃縮真空干燥，得純度為62.86%的總黃酮粉末。

2.2 蘆丁對照品溶液配制

精確稱取蘆丁對照品0.011 0 g，置于50 ml量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.22 mg/ml的蘆丁對照品溶液，備用。

2.3 儲備液和供試品溶液配制

精確稱取鐮形棘豆總黃酮粉末0.087 5 g，置于25 ml量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為3.50 mg/ml的儲備液。精密吸取1 ml儲備液至10 ml量瓶中，用60%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液，備用。

2.4 顯色系統(tǒng)的選擇

2.4.1 最大吸收波長一致性的考察

直接測定法：分別吸取對照品溶液和供試品溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，用60%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻。以60%乙醇為空白，于200～800 nm掃描，記錄最大吸收波長。

AlCl3顯色法：分別吸取對照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml量瓶中，加入0.1mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，再加入1.0 mol/L醋酸鈉5.0 ml，用60%乙醇稀釋并定容至25 ml，搖勻，放置5 min。以60%乙醇為空白，于200～800 nm處掃描，記錄最大吸收波長。

Al(NO3)3顯色法：分別吸取對照品和供試品溶液1.0 ml于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml,搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻放置6 min，繼續(xù)加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以60%乙醇為空白，于200～800 nm處掃描，記錄最大吸收波長。

結(jié)果由圖1可知，直接測定法的對照品與供試品最大吸收波長不一致，而氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法對供試品溶液和對照品溶液的最大吸收波長接近，分別為277 nm和356 nm。筆者進(jìn)一步研究供試品和顯色劑對氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法的影響，以優(yōu)選出鐮形棘豆總黃酮最適顯色系統(tǒng)。

圖1 鐮形棘豆總黃酮測定方法的比較

2.4.2 供試品和顯色劑對反應(yīng)體系干擾的考察

AlCl3顯色法：分別吸取供試品溶液1.0 ml于25ml量瓶中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，再加入1.0 mol/L醋酸鈉5.0 ml，用60%乙醇稀釋并定容至25 ml，搖勻，放置5 min。分別以60%乙醇、供試品和顯色劑為空白，于200～800 nm處掃描，記錄圖譜。

Al(NO3)3顯色法：分別吸取供試品溶液1.0 ml于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1ml,搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻放置6 min，繼續(xù)加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。分別以60%乙醇、供試品和顯色劑為空白，于200～800 nm處掃描，記錄圖譜。

結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知，在AlCl3顯色體系中，以供試品作為空白時，其吸光度值相較于以60%乙醇作為空白時下降，表明供試品本身對AlCl3顯色體系的信號是存在干擾的；以顯色劑作為空白時，其吸光度值相較于以60%乙醇作為空白時保持不變，表明顯色劑對AlCl3顯色體系的信號不存在干擾。由圖2B可知，在Al(NO3)3顯色體系中，以供試品和顯色劑作為空白時，其吸光度值相較于以60%乙醇作為空白時均有所下降，表明供試品和顯色劑對Al(NO3)3顯色體系的信號均存在干擾。

圖2 反應(yīng)體系干擾因素考察圖譜

考慮到干擾因素的可去除性，Al(NO3)3顯色體系顯然不適合鐮形棘豆總黃酮的測定，因為其信號干擾因素供試品和顯色劑無法同時去除。而AlCl3顯色體系則可通過以供試液不加顯色劑作為空白來去除信號干擾，因此選擇AlCl3顯色體系用于鐮形棘豆總黃酮含量的測定，并進(jìn)行顯色條件優(yōu)化。

2.5 顯色條件的優(yōu)化及最優(yōu)顯色條件確定

精密量取供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.4.1”項下方法，依次考察三氯化鋁濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L）、醋酸鈉濃度（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L）、氯化鋁用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml）、醋酸鈉用量（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml）及反應(yīng)時間（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min），試驗結(jié)果表明，當(dāng)氯化鋁濃度為0.3 mol/L，用量為3.0 ml，醋酸鈉濃度為1.0 mol/L，用量為4.0 ml，反應(yīng)時間為16 min時，供試品吸光度值最大且趨于穩(wěn)定。

分別取供試液和對照品溶液1 ml于25 ml量瓶中，加入0.3 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，再加入1.0 mol/L醋酸鈉4.0 ml，用60%乙醇稀釋并定容至25 ml，搖勻，放置16 min，以供試液不加顯色劑為參比，于200～800 nm處掃描，記錄最大吸收波長，結(jié)果見圖3。

圖3 最優(yōu)顯色條件圖譜

2.6 線性與回歸方程

精密量取蘆丁對照溶液（0.22 mg/ml）1、1.5、2、3、4、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，按“2.5”項下顯色條件，制備系列濃度對照品溶液，以供試液不加顯色劑為參比，在277 nm波長處測定吸光度，以蘆丁對照品濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)、吸光度Y（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程為Y=0.035 3X+0.026 7（r=0.999 6），表明在8.8～44.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，蘆丁對照品濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗

精密量取按“2.2”項下制備的蘆丁對照品溶液1.0 ml，6份，置于25 ml量瓶中，按“2.5”項下顯色條件，在277 nm波長處測定吸光度，以吸光度計算RSD為0.15%（n=6），結(jié)果表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

精密量取按“2.3”項下制備的鐮形棘豆總黃酮供試品溶液1.0 ml，6份，置于25 ml量瓶中，按“2.5”項下顯色條件，在277 nm波長處測定吸光度，以吸光度計算RSD為1.97%（n=6），表明本法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

精密量取按“2.3”項下制備的鐮形棘豆總黃酮供試品溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，按“2.5”項下顯色條件，每隔10 min測定一次，在277 nm波長處測定吸光度，以吸光度計算RSD為1.2%（n=6），表明樣品在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗

精密量取按“2.3”項下制備的鐮形棘豆總黃酮供試品溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，再分別加入蘆丁對照品溶液（0.242 mg/ml）0.65、1.00和1.10 ml，每個體積3份，共9份，按“2.5”項下顯色條件，在277 nm波長處測定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算總黃酮含量，并計算得回收率平均值為100.91%，RSD為2.426%（n=9），結(jié)果見表1。

表1 鐮形棘豆總黃酮加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.11 鐮形棘豆總黃酮含量測定

按“2.3”項下方法制備鐮形棘豆總黃酮供試品溶液3批，按“2.5”項下顯色條件，于277 nm波長處測定吸光度，以測得的吸光度結(jié)果計算RSD為3.30%（n=9），結(jié)果見表2。

表2 鐮形棘豆總黃酮含量測定結(jié)果

3 討論

黃酮類化合物是一類廣泛存在于中草藥中的化合物，是植物的重要次生代謝產(chǎn)物。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)中有兩個交叉共軛體系，即A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)和B環(huán)桂皮?；到y(tǒng)，產(chǎn)生兩個紫外吸收譜帶，分別在240～280 nm（Ⅰ）處和300～400 nm（Ⅱ）處。此類化合物的苯環(huán)上多有酚羥基取代，因此在堿性條件下，兩個紫外吸收譜帶可發(fā)生紅移。利用這一光譜性質(zhì)可采用紫外分光光度法進(jìn)行黃酮類化合物含量測定。其中，Al(NO3)3顯色法原理為用亞硝酸鈉先把還原酮還原，再加Al3+進(jìn)行絡(luò)合，最后在NaOH堿性條件下使黃酮C環(huán)裂解生成查爾酮而顯示橙紅色。AlCl3顯色法原理為Al3+可與黃酮的3-羥基-4-羰基、5-羥基-4-羰基和B環(huán)鄰二酚羥基絡(luò)合[16]，使黃酮的紫外吸收譜帶紅移再用該法測定。

不同中藥的總黃酮化合物組分各不相同，其顯色方法需要經(jīng)過研究及驗證?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道[17-19]，單純以顯色劑或供試品作為空白，其干擾因素的影響較為復(fù)雜。本文在顯色方法選擇時發(fā)現(xiàn)供試品和顯色劑對Al(NO3)3顯色體系在356 nm處的信號均存在干擾，其干擾因素?zé)o法去除，并且其專屬性較差，存在多個小峰。而AlCl3顯色體系中，供試品本身對AlCl3顯色體系在277 nm處的信號存在干擾，但顯色劑對AlCl3顯色體系的信號不存在干擾，因此，可通過以供試液不加顯色劑作為空白來去除信號干擾。

通過AlCl3顯色法的顯色條件優(yōu)化，最佳顯色條件為0.3 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，1.0 mol/L醋酸鈉4.0 ml，放置16 min，最大吸收波長為277 nm。經(jīng)方法學(xué)考察，該方法用于鐮形棘豆總黃酮含量測定，具有簡便、快速、準(zhǔn)確和靈敏等優(yōu)點(diǎn)。