阿托品的優(yōu)化給藥方案對(duì)豚鼠近視治療作用的研究

遲晴晴，張 雪，穆 婉，尹 瑤，陳 夢(mèng) （上海市眼病防治中心，上海 200040）

亞洲國家兒童和青少年近視罹患率逐年攀升，嚴(yán)重影響到身心健康，并且隨著近視程度的加深，還可能出現(xiàn)不可逆的眼底改變，嚴(yán)重時(shí)可致盲[1-2]。阿托品是治療近視的首選藥物，廣泛運(yùn)用于臨床。1%阿托品臨床療效確切，能有效預(yù)防和治療近視，然而畏光、刺激、干眼等副反應(yīng)發(fā)生率較高，多數(shù)患者長期使用時(shí)難以耐受[3-7]。多項(xiàng)臨床研究對(duì)不同濃度阿托品的治療作用及副作用深入觀察，發(fā)現(xiàn)0.01%阿托品治療近視時(shí)副作用明顯低于1%阿托品，且停藥后的反彈現(xiàn)象發(fā)生率也顯著降低，但在近視快速進(jìn)展期的控制效果卻不及1%阿托品[8-11]。

因此，積極探索合理的治療方案，在降低阿托品用量的同時(shí)保證其治療效果成為近視治療的關(guān)鍵和難點(diǎn)。本研究采用豚鼠近視模型觀察比較優(yōu)化方案（交替使用1%、0.01%阿托品）與單一濃度方案在近視控制效果上的差異。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇21 d已斷乳的英國三色豚鼠（丹陽市呂城鎮(zhèn)奧臣實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖場(chǎng)），經(jīng)眼健康和屈光度篩選（屈光度為2.0～7.0 D，雙眼屈光參差＜2.0 D，雙眼瞳孔直徑差值＜0.1 mm）后入組。

46只豚鼠隨機(jī)選取6只作為空白對(duì)照組，其余40只隨機(jī)分為5個(gè)干預(yù)組：1%阿托品組、0.01%阿托品組、優(yōu)化組1（1～2周使用1%阿托品，3～4周使用0.01%阿托品）、優(yōu)化組2（1～2周0.01%阿托品，3～4周用1%阿托品）、生理鹽水組。

1.2 造模方法

46只豚鼠均以透明亞克力板鼠籠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房內(nèi)，采用12 h-12 h晝夜循環(huán)節(jié)律，光照度保持在400～500 lux。采用頭套法[12]對(duì)干預(yù)組豚鼠隨機(jī)選擇單眼進(jìn)行形覺剝奪近視造模，并定義為模型眼，對(duì)側(cè)暴露眼為自身對(duì)照眼，所有干預(yù)組豚鼠佩戴頭套4周，每日上午8:00至10:00按分組對(duì)模型眼進(jìn)行滴眼給藥（優(yōu)化組1前2周使用1%阿托品，后2周使用0.01%阿托品滴眼；優(yōu)化組2前2周使用0.01%阿托品，后2周使用1%阿托品滴眼）；空白對(duì)照組豚鼠不采取任何處理。

1.3 數(shù)據(jù)測(cè)量

1.3.1 屈光度

在暗室中用紅外偏心攝影驗(yàn)光儀（昆山德梅內(nèi)克機(jī)器人科技有限公司）測(cè)量小鼠眼球的屈光度。測(cè)量前將豚鼠置于暗室中至少5 min以適應(yīng)光線，隨后將其放在距攝像頭前1 m的可移動(dòng)架子上，調(diào)整豚鼠位置，當(dāng)被測(cè)眼的浦肯野像出現(xiàn)在瞳孔中央時(shí)，記錄測(cè)量屈光度值。每只眼測(cè)量5次，取平均值用于分析。

1.3.2 眼軸

使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物A超（Strong 6000A, 武漢思創(chuàng)眼科）測(cè)量眼軸數(shù)值。測(cè)量前先對(duì)豚鼠進(jìn)行眼球表面麻醉，后將探頭垂直輕貼眼球表面，待波形圖呈現(xiàn)完整峰型時(shí)機(jī)器自動(dòng)記錄數(shù)值。每眼測(cè)量8次，取均值用于分析。

1.3.3 脈絡(luò)膜

豚鼠全身麻醉后立即用Micron OCT成像系統(tǒng)（Phoenix）測(cè)量豚鼠脈絡(luò)膜厚度。麻醉前每5 min用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，共3次。用縫合線將豚鼠上結(jié)膜吊起，角膜表明涂抹氧氟沙星眼膏作為耦合劑和抗菌劑，將光學(xué)探頭按照視軸方向抵近接觸角膜中央?yún)^(qū)，屏幕上可見實(shí)時(shí)二維光學(xué)切片圖，取距離視盤中心1 807 μm處測(cè)量脈絡(luò)膜厚度6次，取均值。

1.3.4 鞏膜

將麻醉后的豚鼠固定于操作臺(tái)，打開胸腔，暴露心尖，用靜脈輸液針插入左心房并注入預(yù)冷的組織固定液，待心臟膨起后立即剪斷右心耳，并繼續(xù)緩慢推入組織固定液，待循環(huán)血全部置換后迅速解剖雙側(cè)眼球，放入眼球固定液，并做好標(biāo)記。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水、包埋、切片處理后采用蘇木素-伊紅染色進(jìn)行鞏膜組織結(jié)構(gòu)及厚度的觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 近視模型的建立

空白對(duì)照組（圖1A、2A）實(shí)驗(yàn)前后雙眼屈光度和眼軸差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。生理鹽水組（圖1 B）屈光度和眼軸長度在1周末時(shí)為（0.88±1.21）D和（7.56±0.10）mm，與實(shí)驗(yàn)前（3.68±1.12）D和（7.38±0.09）mm相比有顯著性差異（P＜0.01），2周 末 時(shí) 該 組 出 現(xiàn) 絕 對(duì) 近 視（-0.33±1.41）D和（7.62±0.08 mm），4周末時(shí)屈光度和眼軸持續(xù)呈近視化改變（-1±2.47）D和（7.74±0.09）mm。給藥各組模型眼屈光度、眼軸長度均有不同程度近視化改變。各干預(yù)組對(duì)照眼的屈光度、眼軸長度于實(shí)驗(yàn)前后均無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果說明豚鼠近視模型建立取得成功。

圖1 各組屈光度隨時(shí)間變化值

2.2 屈光度

空白對(duì)照組（圖1A）雙眼屈光度于實(shí)驗(yàn)前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；生理鹽水組（圖1B）模型眼屈光度迅速下降，每周測(cè)量數(shù)值均與實(shí)驗(yàn)前有顯著差異（P＜0.01）；1%阿托品組（圖1C）模型眼屈光度呈下降趨勢(shì)，于第3、第4周末時(shí)分別降至（1.75±0.69）D和（1.38±1.15）D，均與實(shí)驗(yàn)前（3.50±1.14）D有顯著差異（P＜0.05）；0.01%阿托品組（圖1D）模型眼屈光度快速下降，在第1周末時(shí)與實(shí)驗(yàn)前相比即存在顯著性差異[（1.32±1.15）D 對(duì)（2.82±1.35）D,P＜0.01]，4周末時(shí)出現(xiàn)絕對(duì)近視（-0.64±0.20）D；優(yōu)化組1（圖1E）模型眼屈光度緩慢下降，第4周末時(shí)的屈光度值為（0.95±1.90）D，與實(shí)驗(yàn)前[（3.55±1.85）D]相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），該組抑制屈光度下降結(jié)果低于1%阿托品組，但高于0.01%阿托品組。優(yōu)化組2（圖1F）模型眼實(shí)驗(yàn)前2周快速下降，第2周 末 時(shí) 的 屈 光 度（0.79±0.93）D與 實(shí) 驗(yàn) 前（2.93±1.42）D相比有顯著性差異（P＜0.01）；該組第3周換用1%阿托品后，屈光度回升至（2.10±1.00）D，與第2周末的屈光度值有顯著性差異（P＜0.01）；第4周末時(shí)屈光度值下降至（1.36±1.61）D，與實(shí)驗(yàn)前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組對(duì)照眼實(shí)驗(yàn)前后屈光度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 眼軸

空白對(duì)照組（圖2A）雙眼眼軸長度于實(shí)驗(yàn)前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；生理鹽水組（圖2B）模型眼眼軸迅速延長，每周測(cè)量數(shù)值均與實(shí)驗(yàn)前有顯著差異（P＜0.01）；1%阿托品組（圖2C）模型眼眼軸長度于實(shí)驗(yàn)前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；0.01%阿托品組（圖2D）模型眼于實(shí)驗(yàn)1周時(shí)出現(xiàn)了明顯的眼軸延長（7.47±0.08）mm對(duì)（7.37±0.06）mm，于第4周末時(shí)該組眼軸延長至（7.62±0.08）mm，均與實(shí)驗(yàn)前有顯著差異（P＜0.05）；優(yōu)化組1（圖2E）模型眼造模前眼軸長度為（7.39±0.05）mm，于第2周末時(shí)眼軸長度明顯延長（7.52±0.05）mm，P＜0.05，第3、4周使用0.01%阿托品治療后，2周內(nèi)眼軸延長速度有所減緩[（7.54±0.04）mm和（7.59±0.03）mm]；優(yōu)化組2（圖2F）模型眼眼軸在實(shí)驗(yàn)前2周迅速延長，造模前眼軸長度為（7.37±0.07）mm，實(shí)驗(yàn)1周時(shí)出現(xiàn)了明顯的眼軸延長[（7.50±0.07）mm,P＜0.01]，第3、4周使用1%阿托品治療后眼軸長度為（7.54±0.06）mm和（7.56±0.05）mm，與第2周末相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組對(duì)照眼實(shí)驗(yàn)前后眼軸長度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 眼軸長度隨時(shí)間變化

2.4 脈絡(luò)膜

OCTA結(jié)果提示，空白對(duì)照組脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰。干預(yù)組模型眼脈絡(luò)膜均出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變，如組織厚度下降，邊界模糊等（圖3）。OCTA結(jié)果可見各干預(yù)組脈絡(luò)膜厚度差別較為明顯，大小依次為：1%阿托品組＞優(yōu)化組2＞優(yōu)化組1＞ 0.01%阿托品組＞生理鹽水組（表1）。

表1 各組模型眼脈絡(luò)膜厚度

圖3 各組模型眼脈絡(luò)膜

2.5 鞏膜

HE染色結(jié)果提示，空白對(duì)照組鞏膜組織膠原纖維排列整齊、分布均勻、連接致密。各干預(yù)組模型眼的鞏膜存在不同程度的組織結(jié)構(gòu)改變，如組織厚度變薄、膠原纖維粗細(xì)不均、排列稍紊亂、組織間隙變大等（圖4）。HE染色可見各組鞏膜厚度的差別較明顯，空白對(duì)照組鞏膜厚度為（91.03±1.68）μm，各干預(yù)組豚鼠模型眼的鞏膜厚度均小于空白對(duì)照組，厚度大小依次為：1%阿托品組＞優(yōu)化組2 ＞優(yōu)化組1＞ 0.01%阿托品組＞生理鹽水組（表2）。

表2 各組模型眼鞏膜厚度

3 討論

阿托品是非選擇性M受體拮抗劑，從19世紀(jì)就開始用于近視治療，目前仍在臨床廣泛使用。大量研究證實(shí)阿托品是目前控制近視進(jìn)展最有效的藥物[13-14]，也是臨床上治療近視使用度最高的藥物，但是在臨床應(yīng)用過程中1%阿托品的副作用一直備受爭(zhēng)議。國內(nèi)外已有大量研究報(bào)道0.01%阿托品在長期控制近視中有較好效果，并且其副作用及停藥反彈現(xiàn)象較輕，但是短期內(nèi)對(duì)于迅速發(fā)展的近視控制效果欠佳[6,11]。本研究結(jié)合不同濃度阿托品的作用優(yōu)勢(shì)和臨床實(shí)際提出優(yōu)化方案1，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明優(yōu)化方案1同樣能有效控制屈光度的快速發(fā)展，但是該方案對(duì)于抑制眼軸增長作用和對(duì)脈絡(luò)膜、鞏膜形態(tài)保護(hù)作用不如1%阿托品組，可能因?yàn)?.01%濃度過低，對(duì)組織、形態(tài)上作用力不足。此外，有研究表明，給予明亮光照和阿托品可協(xié)同刺激眼內(nèi)多巴胺的生成，有助于延緩近視發(fā)展[15]，但是1%濃度的阿托品因畏光發(fā)生率為62.12%（205/330，中國香港）[16]，對(duì)于聯(lián)合光照治療有較大局限，而0.01%阿托品的畏光發(fā)生率為2.1%（2/110，中國云南）[17]，1%阿托品有效控制近視發(fā)展后，采取0.01%阿托品結(jié)合沐浴陽光療法維持防治效果也為近視治療提供一種可能。近期有學(xué)者針對(duì)0.01%～0.1%濃度進(jìn)行臨床隨機(jī)對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)較低濃度的阿托品滴眼液如0.05%、0.025%表現(xiàn)出更好的防控效果，在2年內(nèi)最有效地控制了屈光度進(jìn)展和眼軸延長，且對(duì)視力相關(guān)生活質(zhì)量均無不良影響[17-19]，提示在0.01%和0.1%濃度阿托品之間還存在更優(yōu)治療濃度，因此本研究的優(yōu)化方案1中維持治療濃度還需進(jìn)一步探究。

脈絡(luò)膜和鞏膜在形覺剝奪性近視和離焦性近視中對(duì)于眼焦調(diào)整以及眼球生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，近視眼中均存在不可逆脈絡(luò)膜、鞏膜變薄的情況，臨床同樣證明，脈絡(luò)膜、鞏膜厚度與近視的嚴(yán)重程度高度相關(guān)[19-20]。近年來，國外臨床上常使用0.01%阿托品治療早期近視，或?qū)h(yuǎn)視儲(chǔ)備不足的患者進(jìn)行預(yù)防治療[20]。但是其在短時(shí)間內(nèi)對(duì)于快速發(fā)展的近視控制效果欠佳，對(duì)于脈絡(luò)膜和鞏膜的保護(hù)作用效果不如1%阿托品[21]。優(yōu)化方案2發(fā)現(xiàn)，該組給藥方案對(duì)于脈絡(luò)膜和鞏膜纖維層結(jié)構(gòu)和形態(tài)的維持作用接近1%阿托品組，并且明顯優(yōu)于0.01%阿托品組。值得注意的是，當(dāng)0.01%阿托品換為1%阿托品后，近視發(fā)展方向被翻轉(zhuǎn)，明顯向遠(yuǎn)視方向移動(dòng)，4周末時(shí)該組對(duì)屈光度控制效果優(yōu)于1%阿托品組，并且眼軸增長速度較0.01%阿托品組明顯緩慢。該結(jié)果提示，在近視早期治療時(shí)使用0.01%阿托品，當(dāng)近視控制效果不佳時(shí)換用高濃度阿托品（如1%）對(duì)于近視治療時(shí)機(jī)并未產(chǎn)生影響，也未加重脈絡(luò)膜和鞏膜結(jié)構(gòu)的不可逆改變。這一結(jié)果與Wu等[22]在臨床實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)論一致，即從低濃度阿托品（如0.01%）開始治療，當(dāng)控制效果不夠有效（≥0.5 D/6個(gè)月，亞洲）時(shí)，可以考慮增加阿托品濃度代替治療。

本研究也存在一定局限性。與臨床研究周期相比，本研究觀察時(shí)間尚短，不能提供長期使用的控制效果數(shù)據(jù)。并且，在實(shí)驗(yàn)期間報(bào)告了幾種給藥方案的治療效果，但未進(jìn)行停藥后效果的監(jiān)測(cè)，該部分在下一步的研究中會(huì)開展相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。此外，優(yōu)化組2換用1%阿托品后，模型眼屈光度出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。本研究尚未對(duì)此深入探究，目前無法判斷具體影響因素，對(duì)于翻轉(zhuǎn)作用的機(jī)制未來需要作進(jìn)一步研究。