基于激光介導富集的表面增強拉曼分析

唐文濤，李圣凱，王 昚，陳 龍，陳 卓

（1.湖南大學化學化工學院,化學生物傳感與計量學國家重點實驗室,分子科學與生物醫(yī)學實驗室,長沙410082；2.澳門大學科技學院,澳門999078）

痕量目標分析物的特異性檢測在生化分析和環(huán)境監(jiān)測等領域具有重要意義［1~3］.目前，已開發(fā)出多種光譜技術用于痕量待測物的分析，其中表面增強拉曼散射（SERS）技術被認為是最有前途的技術之一［4，5］.SERS技術具有眾多優(yōu)勢［6~8］：（1）能夠反映待測物內在的分子指紋信息；（2）對待測樣品的損傷小，檢測靈敏度高，甚至可以實現單分子檢測；（3）抗光漂白和抗碳化能力強；（4）基于拉曼光譜帶寬窄的特點，在單一波長光激發(fā)下能夠實現多目標物的分析；（5）水的拉曼散射信號極其微弱，不會造成大的背景干擾.根據電磁場增強機理，SERS信號強度與增強基底電磁場熱點附近的待測物分子數量呈正相關，因而實現SERS基底附近待測物分子的有效富集是實現痕量分析的關鍵［9，10］.

研究者開發(fā)了多種待測物分子的有效富集方法以實現靈敏的SERS分析，主要有靶標誘導捕獲法［11~13］、超疏水界面誘導濃縮法［14~17］和吸附劑輔助濃縮法［18，19］.其中，靶標誘導捕獲法需要特定的靶標以選擇性地捕獲分子，但是引入的拉曼標簽會造成背景干擾；超疏水界面誘導濃縮法利用不潤濕的底物來濃縮水溶性分析物，但是超疏水界面的構建方法復雜且昂貴；而吸附劑輔助濃縮法在富集待測物時，使用的吸附劑會導致待測物難以靠近電磁場熱點附近.上述3種方法都屬于被動的分子吸附方式，捕獲效率低且耗時長.近年發(fā)展起來的液滴蒸發(fā)自組裝濃縮法有利于主動富集待測物，然而當蒸發(fā)液滴濃縮到較小時會發(fā)生Cassie-Wenzel轉變，導致“咖啡環(huán)效應”［20~22］.因此，有必要提出一種能主動高效富集待測物，同時能有效避免“咖啡環(huán)效應”的策略，以實現痕量待測物的可靠SERS分析.

本文構建了一種新的激光介導的待測物富集策略，實現了水溶液中9，10-雙苯乙炔基蒽（BPEA）分子的痕量SERS分析.基于石墨烯隔離的金納米晶（GIAN）顆粒良好的SERS性能以及能夠在水-二氯甲烷（DCM）兩相界面自組裝的特點，將少量GAIN顆粒和DCM加入到含有待測物BPEA的水溶液中并充分振蕩，在溶液底部形成含有GIAN顆粒的DCM小油滴.利用BPEA分子在DCM中的分配系數大于其在水中的分配系數以及富含π電子體系的GIAN外殼與BPEA的π-π相互作用［23，24］，在激光的照射下具有優(yōu)異的光熱升溫能力的GAIN［25］大量產熱使得小油滴上下往復運動，在34 min內實現了BPEA分子的高效富集，最后通過SERS測試證明該策略能夠實現痕量分析物的檢測，實驗原理如Scheme 1所示.

Scheme 1 Mechanism of laser?mediated analyte enrichment and detection of BPEA

本文構建的激光介導的痕量待測物富集策略的整個富集過程均在液相體系中進行，在一定程度上避免了因“咖啡環(huán)效應”帶來的SERS信號波動，且利用GIAN位于拉曼靜默區(qū)（1800~2800 cm?1區(qū)間［7］）的特征峰作為內標可以提高拉曼定量分析的準確性，因而在生化分析和環(huán)境監(jiān)測等領域具有潛在的應用價值.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氣相SiO2購于上海麥克林生化科技有限公司；結晶紫（CV）、羅丹明6G（R6G）、孔雀石綠（MG）和羅丹明B（RhB）購于西格瑪奧德里奇生物試劑公司；9，10-雙苯乙炔基蒽（BPEA）購于上海薩恩化學技術有限公司；四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）和氫氧化鈉（NaOH）購于上海國藥試劑公司；氫氟酸（HF）、二氯甲烷（DCM）、環(huán)己烷（CH）、甲醇（MeOH）和乙酸乙酯（EA）均購于長沙化學試劑公司.所用試劑均為分析純且未經處理直接使用；實驗用水為電阻率18.2 MΩ·cm的二次蒸餾水（ddH2O）.

JEOL 2010型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Zeta sizer Nano ZS90型激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；inVia reflex型激光共聚焦拉曼光譜儀（英國雷尼紹公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 GIAN的合成參考文獻［25］報道的化學氣相沉積法制備石墨烯隔離的金納米晶（GIAN）.稱量1.0 g氣相SiO2加入到盛有80 mL甲醇的250 mL圓底燒瓶中，超聲1.5 h；加入6 mL 1%HAuCl4甲醇溶液和80 mL甲醇，繼續(xù)超聲0.5 h；通過旋轉蒸發(fā)去除上述混合溶液中的甲醇，將獲得的淡黃色粉末置于45°C烘箱中干燥過夜；然后將干燥的粉末充分研磨，置于管式爐中進行CVD生長（實驗條件：加熱溫度為1000°C，升溫時間為50 min，恒溫時間為25 min，CH4和H2流量分別為150和20 cm3/min）；將得到的粗產物轉移至HF中以刻蝕SiO2模板；最后用超純水將GIAN產物洗滌至中性，置于烘箱中干燥得到GIAN粉末.

1.2.2 GIAN的穩(wěn)定性測試分別稱量0.6 mg GIAN置于2 mL DCM，H2O，CH，MeOH和EA溶劑中浸泡0，3，6，12或24 h后，測量GIAN顆粒相應的拉曼光譜（532 nm激光，強度為50 mW）.

1.2.3 GIAN的SERS效應探究將不同濃度的CV和R6G與1 mg GIAN粉末共孵育30 min，然后將其轉移至載玻片上，自然風干，最后測量相應的拉曼光譜.

1.2.4 稱量瓶的處理將稱量瓶放置在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min，使其內壁親水性增強，然后用ddH2O進行多次洗滌，最后置于通風處自然晾干.

1.2.5 “水包油”結構SERS基底的構建及運動能力探究將含有50 μg GIAN顆粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL ddH2O的稱量瓶中，充分振蕩10 min，靜置.將稱量瓶轉移至超聲儀中進行超聲處理，并用相機記錄超聲前后溶液中小油滴的位置變化.

1.2.6 超聲介導的相界面待測物富集體系的構建將含有50 μg GIAN顆粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL 100 nmol/L BPEA水溶液的稱量瓶中，充分振蕩10 min，靜置.將稱量瓶轉移至超聲儀中進行超聲處理，用相機記錄超聲前后溶液中小油滴的顏色變化.

1.2.7 激光介導的相界面待測物富集與檢測體系的構建將含有50 μg GIAN顆粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL不同濃度BPEA水溶液的稱量瓶中，充分振蕩10 min，靜置.用655 nm激光（強度為2 W/cm2）對準油滴加熱34 min，用相機記錄超聲前后溶液中小油滴的顏色變化，最后將油滴轉移至載玻片表面，自然風干后測量其拉曼光譜.

2 結果與討論

2.1 GIAN的表征

由圖1（A）所示透射電子顯微鏡（TEM）照片可見，GIAN的微觀形貌為球型，平均粒徑約為53 nm.從圖1（B）所示高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）照片可以觀察到GIAN內部Au核外面包覆有少層石墨烯，石墨烯殼層厚度約為1.5 nm，晶格間距約為0.34 nm.如圖1（C）所示，GIAN的ζ電勢約為?4.76 mV.在圖1（D）所示紫外-可見吸收（UV-Vis）光譜圖中GIAN有2個特征吸收峰，其中位于~560 nm處的峰來源于內部Au核的局域表面等離子體共振吸收，位于~265 nm處的峰來源于外層石墨烯殼的特征吸收.

Fig.1 TEM image(A)and HRTEM image(B)of GIAN,zeta potential(C)and UV?Vis spectrum(D)of GIAN aqueous solution

2.2 GIAN的穩(wěn)定性

如圖2（A）所示，GIAN顆粒有3個來源于石墨烯外殼的拉曼散射特征峰，分別為D（1350 cm?1），G（1590 cm?1）和2D（2700 cm?1）峰，與前文報道結果一致［26，27］.為了進一步探究GIAN顆粒在不同溶劑中的穩(wěn)定性，將GIAN顆粒分別在DCM，H2O，CH，MeOH和EA中浸泡0，3，6，12和24 h，然后分別測量其拉曼光譜.如圖2（B）所示，GIAN顆粒在不同溶液中浸泡不同時間，其2D峰強度始終無明顯變化，證明GIAN在不同有機溶劑中具有優(yōu)異的穩(wěn)定性.

Fig.2 Stability study of GIAN

2.3 GIAN的SERS效應

分別以CV和R6G為模型分子，探究了GIAN作為SERS基底的增強效果.如圖3所示，100 μmol/L CV，1 mmol/L R6G，10 μmol/L MG和1 mmol/L RhB水溶液的本征拉曼信號非常微弱，而1 μmol/L CV，10 μmol/L R6G，1 μmol/L MG和10 μmol/L RhB在GIAN基底的作用下均檢測到非常強的SERS信號.上述實驗結果表明，GIAN顆粒具有良好的SERS效應，能夠作為良好的SERS分析平臺.

Fig.3 Raman spectra of CV(A),R6G(B),MG(C)and RhB(D)with or without GIAN incubation under 633 nm(17 mW)laser excitation

2.4 GIAN的液-液界面自組裝

如圖4（A）~（C）所示，未經任何修飾的GIAN沉積于盛有H2O和有機溶劑的玻璃瓶底部，說明GIAN在H2O和有機溶劑中的溶解度有限.然而，GIAN能夠自發(fā)地組裝于H2O和有機溶劑兩相界面處，這可能因為H2O和有機溶劑界面處的界面能很低且熱波動與自由能之間相對平衡，從而促使GIAN在兩相界面處自組裝［28，29］.如圖4（D）和（E1）所示，本工作構建的“水包油”體系中形成的小油滴沉于稱量瓶的底部，然后將構建的“水包油”體系進行超聲處理（實驗步驟見1.2.5節(jié)）.由于超聲波空化作用，小油滴附近產生氣泡，油滴的浮力變大從而向上移動［圖4（E2）］，超聲停止一段時間后油滴再次下沉，循環(huán)往復數次后小油滴的體積縮小［圖4（E3）］，說明在超聲作用下有部分DCM揮發(fā).此外，由于稱量瓶經NaOH溶液處理后其內壁親水性較好，小油滴不會黏附在瓶底和瓶壁，從而不會阻礙小油滴的運動.上述實驗結果表明，本文構建的“水包油”體系在外力作用下能夠自由移動并促使小油滴濃縮，基于GIAN優(yōu)異的SERS效應，有望構建高效的待測物濃縮體系以實現靈敏的SERS分析.

Fig.4 Self?assembly of GIAN in immiscible two?phase interfaces

2.5 激光介導的待測物富集與檢測體系的構建

上述實驗結果表明，超聲有助于“水包油”體系中小油滴的濃縮，以微溶于水的BPEA分子為模型，進一步探究了該策略的富集效率（實驗步驟見1.2.6節(jié)）.實驗過程中發(fā)現，小油滴附近產生氣泡且上下往復運動，超聲130 min后無色的小油滴濃縮成極其微小的黃綠色油滴（圖5），證明小油滴能夠富集BPEA，且GIAN密集分布在油滴表面，沒有產生明顯的咖啡環(huán)效應.然而，這一通過超聲富集BPEA的方法耗時太長，在實際的分析檢測中可行性較差.

Fig.5 Enrichment of BPEA in oil?in?water treated with ultrasound

前文［25］已報道GIAN具有良好的光熱轉換效果，且熱能夠加速分子的運動.后續(xù)實驗利用激光誘導油滴內部的GIAN顆粒升溫（實驗步驟見1.2.6節(jié)）.實驗中發(fā)現，小油滴的運動狀況與超聲處理相類似，小油滴附近產生氣泡并上下往復運動，隨著時間的延長小油滴的體積縮小，且在34 min后無色的小油滴濃縮成極其微小的黃綠色油滴（圖6），說明激光加熱的方式對BPEA的富集效率高于超聲處理.我們推測導致上述實驗結果的可能原因如下：BPEA分子在DCM中的分配系數大于其在H2O中的分配系數，富含π電子體系的GIAN外殼能夠通過π?π相互作用與BPEA結合，激光介導GAIN產生大量的熱使得油滴快速地上下往復運動，并伴隨著部分DCM的蒸發(fā)，從而實現BPEA分子的高效富集和濃縮.

Fig.6 Enrichment of BPEA in oil?in?water under laser irradiation

通過拉曼測試進一步證實了激光介導的高效富集效率.如圖7（A）所示，未觀察到單獨BPEA以及BPEA/GIAN混合體系的拉曼信號；而BPEA/GIAN混合體系經激光照射后，可明顯觀察到位于2180 cm?1處（紅色方框標注）的拉曼散射特征峰，此峰來源于BPEA分子中C≡C的伸縮振動，證明激光加熱的方式能夠提高SERS分析的靈敏度.基于此，進一步利用構建的富集方法實現了BPEA分子的定量分析.如圖7（B）和（C）所示，BPEA在30~1000 nmol/L范圍內與其拉曼強度呈一定的線性關系，其檢出限低至10 nmol/L.值得注意的是，利用GIAN位于拉曼靜默區(qū)的2D峰作為內標時［圖7（C）］，相關系數由0.739提升至0.975，這充分說明利用內標可以提高拉曼定量分析的準確性.此外，本工作構建的富集方法具有優(yōu)異的重現性（見圖8），在實際的SERS分析應用中具有一定的應用潛力.

Fig.7 Laser?mediated enrichment and detection of analytes

Fig.8 Reproducibility of the laser?mediated enrichment strategy

3 結 論

基于兼具有光熱和SERS效應的GIAN顆粒能夠在H2O-DCM兩相界面自組裝的特點，構建了激光介導的待測物富集策略，實現了微溶于水的BPEA分子的痕量SERS分析.實驗結果表明，激光介導策略實現了BPEA的有效富集，因為BPEA分子在DCM中的分配系數大于其在H2O中的分配系數，GIAN能夠通過π?π相互作用與BPEA結合以及在激光的照射下GAIN大量產熱使得油滴上下往復運動，從而實現BPEA分子的高效富集.SERS分析結果表明，利用此富集策略可實現100 nmol/L BPEA的檢測，而將同濃度的BPEA分子與GIAN直接混合則檢測不到任何信號.基于此，進一步實現了BPEA的定量分析檢測，利用GIAN位于拉曼靜默區(qū)的2D峰作為內標提高了拉曼定量分析的準確性，且證實了該富集方法具有良好的重現性.值得一提的是，同一體系中通過超聲的方式介導BPEA的富集需用時130 min，遠高于本工作構建的激光介導的富集方法.此外，本工作構建的激光介導的富集方式在一定程度上避免了因“咖啡環(huán)效應”帶來的信號波動，有望實現復雜樣品中痕量分析物的高效富集與靈敏的SERS檢測.